不同供鎂水平對(duì)杉木幼苗葉片抗氧化酶活性和葉綠素含量的影響

劉 麗 ，費(fèi)裕翀，路 錦，陳 鋼，黃 櫻，葉義全，2，曹光球，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.國(guó)家林業(yè)和草原局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

【研究意義】鎂元素是植物體內(nèi)的中量元素，主要存在于植物幼嫩器官和組織中，是葉綠素的重要組成成分和多種酶的催化劑[1-3]。鎂原子處于葉綠素分子的中心位置，對(duì)細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用，也是葉綠素中唯一的金屬元素[4]。葉綠體是植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要場(chǎng)所，缺鎂可改變PSⅠ系統(tǒng)中電子的傳遞方向，促使活性氧生成[5-6]。植物細(xì)胞中的活性氧處于動(dòng)態(tài)代謝平衡狀態(tài)，一旦活性氧的形成失控，代謝平衡被打破，過(guò)量活性氧會(huì)攻擊堿基、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜系統(tǒng)，改變細(xì)胞膜透性，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)外代謝紊亂[7-10]，或次生代謝物造成間接傷害，使細(xì)胞受到損傷，MDA 在細(xì)胞內(nèi)累積[11-12]。此外缺鎂會(huì)造成植物體內(nèi)的淀粉、蔗糖、碳水化合物代謝受阻，含量積累[13-15]。【前人研究進(jìn)展】陳偉立[16]在缺鎂脅迫對(duì)‘砂糖橘’（Citrus reticulateBlanco cv.Shatangju）的研究中發(fā)現(xiàn)90 d 的缺鎂脅迫導(dǎo)致植株葉片中活性氧積累，葉綠素含量顯著降低，POD 和CAT 活性提高。李延等[17]對(duì)龍眼（Dimocarpus longanaLour.）的研究中發(fā)現(xiàn)，隨缺鎂脅迫加重，龍眼光合速率、蛋白質(zhì)含量、核酸含量下降，細(xì)胞膜系統(tǒng)過(guò)氧化加劇，葉片衰老明顯。缺鎂影響植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育，但過(guò)量施鎂同樣也不利于植物生長(zhǎng)[18]。施鎂過(guò)量，影響植物對(duì)其它元素的正常吸收，植物營(yíng)養(yǎng)失衡及生長(zhǎng)量下降。凌麗俐等[18]研究表明，過(guò)量鎂脅迫使紐荷爾臍橙（Citrus sinensisOsbeck‘Newhall’）嫩葉和老葉的葉綠素含量均降低，阻礙葉片光合作用。確定合理的施鎂量，對(duì)于構(gòu)建植物種的高效培育技術(shù)體系意義重大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國(guó)獨(dú)有樹(shù)種，是我國(guó)南方主要造林速生樹(shù)種之一[19]。杉木具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，被廣泛用于房屋建造、造船、家具等領(lǐng)域[20-21]。杉木生長(zhǎng)、發(fā)育所需的鎂主要來(lái)源是土壤。土壤中鎂的豐缺與其理化結(jié)構(gòu)、分子組成和土壤陽(yáng)離子交換量等因素有關(guān)[22]。能被植物直接吸收利用的鎂是有效鎂，有效鎂溶解于土壤溶液中，易移動(dòng)易被吸收。長(zhǎng)期以來(lái)，杉木連栽導(dǎo)致土壤地力不斷下降，加之南方多雨天氣對(duì)土壤的沖刷，使林地土壤鎂含量風(fēng)化淋失、養(yǎng)分下降、肥力匱乏。此外不合理的耕作和施肥措施等問(wèn)題的頻繁出現(xiàn)，土壤中的鎂元素大量流失，植物的缺鎂癥狀越加嚴(yán)重[23-24]。近年來(lái)，關(guān)于南方地區(qū)土壤缺鎂現(xiàn)象已有較多報(bào)道。汪鳳林等[25]研究表明，杉木幼苗缺鎂抑制根系活力，影響根系對(duì)養(yǎng)分元素的吸收。嚴(yán)紹裕[26]在對(duì)杉木幼苗各器官的研究表明，隨鎂濃度的提升，各器官鎂含量提高，促進(jìn)光合作用。隨鎂濃度的提高，杉木幼苗發(fā)育和生長(zhǎng)更具優(yōu)勢(shì)。在以往杉木幼苗室內(nèi)水培試驗(yàn)中，大多數(shù)學(xué)者采用Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液。Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液中的Mg 含量是否是杉木幼苗培養(yǎng)的最適濃度，目前尚未有相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本文以Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液為基礎(chǔ)，通過(guò)分析Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液中不同供鎂水平對(duì)1 年生杉木無(wú)性系葉片丙二醛含量、抗氧化酶活性及葉綠素含量的影響，確定適合于杉木幼苗的最佳濃度，從而為今后杉木研究及壯苗培育提供理論參考和依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在杉木幼苗培養(yǎng)中，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)液具體供鎂濃度的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，為使杉木品質(zhì)和產(chǎn)量提升，本試驗(yàn)在不同鎂濃度對(duì)杉木幼苗處理的基礎(chǔ)上，嘗試從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度解決杉木對(duì)鎂元素生長(zhǎng)需求問(wèn)題，為杉木的培育和種植提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)田間實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)大棚中進(jìn)行。選用福建省洋口國(guó)有林場(chǎng)培育的長(zhǎng)勢(shì)較一致的杉木1 年生061 無(wú)性系苗為試材，苗木平均株高為19.3 cm，地徑為0.54 cm，冠幅27.4 cm。培養(yǎng)容器為直徑20 cm 四周涂成黑色的塑料桶（V=4 L）。用純凈水將根部清凈后，置于裝有純凈水的培養(yǎng)桶中培養(yǎng)2 d，再將幼苗移入Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液（KH2PO4為0.136 g/L，KNO3為0.510 g/L，Ca（NO3）2·4H2O 為0.820 g/L，MgSO4·7H2O 為0.490 g/L，*EDTA-Fe 為0.014 g/L，H3BO4為2.860 mg/L，H2MoO4為0.062 mg/L，MnCl2·4H2O為1.810 mg/L，ZnSO4·7H2O 為0.220 mg/L，CuSO4·5H2O 為0.080 mg/L。）中馴化7 d。馴化結(jié)束后置于裝有相同質(zhì)量沙的培養(yǎng)桶中進(jìn)行試驗(yàn)，添加液高于沙表面約5 cm。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的觀測(cè)結(jié)果，本試驗(yàn)在完全營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加不同濃度的Mg 溶液，Mg 添的濃度設(shè)置4 個(gè)處理，分別為：0.2 mmol/L（M1）、0.4 mmol/L（M2）及0.8 mmol/L（M3），以不添加鎂為對(duì)照（M0），鎂以MgSO4·7H2O 的形式加入。缺鎂營(yíng)養(yǎng)液通過(guò)添加Na2SO4使處理間的SO42-濃度保持一致。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)培養(yǎng)15株幼苗。

試驗(yàn)期間每天06：00 和18：00 各通氣一次，每次時(shí)間為30 min。培養(yǎng)第一天開(kāi)始測(cè)定試驗(yàn)指標(biāo)，每隔15 d測(cè)量一次，共測(cè)量4次。

1.2 測(cè)定方法

葉片收集：用洗干凈消毒后的剪刀取下同一位置杉木健康新生葉片，置于寫(xiě)有標(biāo)簽鋪有濕濾紙的自封袋中暫時(shí)存放。

1.2.1 丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的測(cè)定 杉木葉片MDA 含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸TBA比色法進(jìn)行[27-29]。

杉木葉片CAT 活性測(cè)定采用紫外吸收法[27-29]。反應(yīng)體系（pH 值7.8 的3 mL 0.005 mol/L 的磷酸鈉緩沖液（PBS），0.9 mL 0.08%的H2O2，0.1 mL 粗酶提取液），對(duì)照試驗(yàn)用PBS 緩沖液代替酶液。在240 nm 下每隔1 min測(cè)量一次吸光值，連續(xù)測(cè)量4次。

杉木葉片SOD 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法來(lái)進(jìn)行[27-29]。試驗(yàn)以pH7.8 磷酸鈉緩沖液0.1 mL 代替酶液，置于暗處，其余處理置于4 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，結(jié)束后將各處理立即放在暗處終止反應(yīng)，在560 nm下測(cè)各管的吸光度。酶活力測(cè)定以NBS被抑制50%作為1個(gè)SOD酶活單位。

杉木葉片POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法來(lái)進(jìn)行[27-29]。對(duì)照酶液煮沸5 min 處理。反應(yīng)于34 ℃恒溫水浴反應(yīng)3 min，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每隔1 min記錄1次吸光值，連續(xù)測(cè)量4次。將單位時(shí)間內(nèi)A470吸收值轉(zhuǎn)化為0.01作為1個(gè)酶活性單位。

1.2.2 葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定方法 測(cè)定葉綠素含量用丙酮-無(wú)水乙醇的提取法[30]。稱(chēng)取杉木葉片0.05 g，擦凈剪碎，將樣品和反應(yīng)體系（99%2.5 mL 的乙醇、2.5 mL 的丙醛）用保險(xiǎn)膜封口，置于25 ℃室溫靜置到材料變白，在663 nm、645 nm波長(zhǎng)下測(cè)測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方差分析及最小差異顯著性檢驗(yàn)用SPSS處理，采用Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供鎂水平對(duì)杉木葉片MDA含量、抗氧化酶酶活性的影響

MDA是植物膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物[31]。如圖1所示，隨試驗(yàn)處理時(shí)間延長(zhǎng)，杉木幼苗葉片MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在相同處理下，不同處理時(shí)間MDA 含量由大到小依次為30，15，1，45 d。其中M0處理下，在30 d時(shí)MDA含量比1，15，45 d分別提高121.63%、47.86%和125.62%，不同時(shí)間間均存在顯著差異。

處理1 d 時(shí)，M0、M1、M2、M3的MDA 含量無(wú)明顯規(guī)律。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，15 d 時(shí)，M1的MDA 含量顯著上升，分別比M0、M2、M3提高24.92%、22.37%和18.93%，但差異并未達(dá)到顯著水平。4 個(gè)處理中M2的MDA 含量始終處于較低水平，在30～45 d 時(shí)，由大到小依次為M0、M1、M3和M2，其中45 d 時(shí)，M0、M1、M3的MDA含量比M2顯著提高54.92%、51.32%和49.25%。

抗氧化酶系統(tǒng)在植物衰老機(jī)制中占有重要作用，尤其是SOD、CAT、POD 等被認(rèn)為是清除活性氧最主要的抗氧化酶類(lèi)[32]。從圖1 可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、POD 活性總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，CAT 活性總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。1～15 d，相同處理的SOD、POD 活性均顯著提高，15 d 時(shí)，M0、M1、M2、M3的SOD 活性比1 d 提升29.89%、20.27%、27.03% 和27.73%，POD 活性分別提升155.96%、195.20%、223.82% 和233.40%。45 d 時(shí)，M2、M3的SOD 活性與30 d 相比，顯著提高12.30%、11.89%。45 d 時(shí)M0、M1.M2、M3的POD活性比30 d分別提高118.0%、173.63%、151.12%和49.55%，均存在顯著差異。

圖1 不同供鎂水平對(duì)杉木幼苗葉片丙二醛含量和保護(hù)酶活性的影響Fig.1 Effects of different levels of magnesium supply on MDA content and protective enzymes activities in Cunninghamia lanceolata seedling leaves

M1、M2、M3在不同處理時(shí)間CAT 活性總體由大到小依次為15，1，30，45 d，在15 d 時(shí)，M1、M2、M3的CAT活性比1 d提高7.16%、18.20%和28.97%，比45 d提高104.76%、66.18%和52.85%，均存在顯著差異。M0的CAT 活性總體呈上升趨勢(shì)，即由大到小依次為45，15，1，30，45 d 的CAT 活性比1 d 顯著提高54.72%。

在相同時(shí)間下，4 個(gè)處理中M2的SOD 活性始終處于較高水平。1～15 d 時(shí)，M0、M1、M2、M3的SOD 活性無(wú)明顯規(guī)律。30～45 d 時(shí)，各處理間由大到小依次為M2、M3、M0和M1的趨勢(shì)，其中45 d 時(shí)，M2的SOD 活性比M0、M1、M3提高11.46%、19.59%和3.28%。POD 在同一時(shí)間不同處理之間無(wú)明顯變化規(guī)律，45 d時(shí)，M2的POD 活性比M0、M1、M3提高4.58%、5.49%和1.39%。相同處理時(shí)間，CAT活性在各處理間無(wú)明顯規(guī)律，處理45 d時(shí)，M0的CAT活性比M1、M2、M3顯著提高202.79%、128.81%和81.97%。

2.2 不同供鎂水平對(duì)杉木葉片葉綠素含量的影響

葉綠素含量越高，光合能力越強(qiáng)，增產(chǎn)潛力越大。適量施鎂能維持細(xì)胞膜的完整性、穩(wěn)定性，降低質(zhì)膜的透性，減少細(xì)胞內(nèi)的外滲物，為細(xì)胞抵御不良外界環(huán)境提供了良好條件[33]。由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Cha、Chb、Chl的含量總體由大到小依次為45，30，15，1，45 d時(shí)Cha的含量比1 d時(shí)高110.43%、110.19%、144.20%和128.16%，Chb 的含量比1 d 時(shí)高63.22%、101.31%、137.60%和101.53%，Chl 的含量比1 d時(shí)高110.43%、110.19%、144.20%和128.16%，均呈顯著差異。

在相同時(shí)間，不同處理間，Cha、Chb、Chl 含量總體無(wú)明顯的規(guī)律，其中M1和M3變化較一致，各葉綠素含量無(wú)顯著差異，M0、M2的葉綠素含量總體高于M1、M3，且M2＞M0。在45 d時(shí)，Cha、Chl含量由大到小均為M2、M3、M0和M1，M2的Cha 含量比M0、M1、M3提升3.82%、11.43%和5.22%，M2的Chb 含量比M0、M1、M3提升53.38%、26.20%和18.74%，M2的Chl含量比M0、M1、M3提升13.91%、15.12%和8.62%，均存在顯著差異。

圖2 不同供鎂水平對(duì)杉木幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of different levels of magnesium supply on chlorophyll content in Cunninghamia lanceolata seedling leaves

2.3 不同供鎂水平對(duì)杉木葉片生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

將不同濃度處理下的杉木幼苗葉片各生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1 所示。MDA 含量與POD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），SOD 活性與POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Cha 含量、Chb 含量、Chl含量與SOD、POD活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Chb含量與CAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；Cha含量、Chb含量、Chl含量之間也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

表1 不同供鎂水平下杉木幼苗葉片MDA含量和保護(hù)酶的關(guān)系Tab.1 The relationship between MDA content and protective enzyme in seedling leaves of Cunninghamia lanceolata under different magnesium levels

3 討論與結(jié)論

MDA 是植物膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量反應(yīng)細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度[34-35]。在逆境條件下，植物細(xì)胞活性氧積累，破壞膜系統(tǒng)，擾亂細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致葉片的MDA 含量增加，含量越高，表明細(xì)胞受損害程度越大[36-37]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，培養(yǎng)前期MDA 含量隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，處理30 d 時(shí)達(dá)到最高，M0含量最高，MDA 含量在30～45 d不斷下降，M2含量最低。處理前期，因處理液濃度增大，杉木幼苗對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)激性，MDA 含量不斷升高。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，杉木幼苗因自身的適應(yīng)性、抗逆性和防御酶系統(tǒng)的激活，MDA 含量不斷下降，其中M2的MDA 含量顯著低于其他處理，由此推測(cè)，M2的濃度更有利于杉木幼苗的生長(zhǎng)。作為正常供鎂的M0處理，MDA 含量高于其他處理，可能是因?yàn)樵囼?yàn)材料的個(gè)體差異或種系差異，需鎂量在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，并不是一個(gè)確定的濃度值。此結(jié)果與汪鳳林等[25]的研究結(jié)果有所不同，原因可能是本試驗(yàn)研究是在一定供鎂基礎(chǔ)上篩選最優(yōu)含鎂營(yíng)養(yǎng)液對(duì)杉木幼苗培育的影響，汪鳳林等則研究供鎂與缺鎂處理對(duì)杉木幼苗發(fā)育的影響。

SOD、CAT、POD等酶是植物細(xì)胞中重要的防御保護(hù)酶，清理細(xì)胞中破壞代謝的過(guò)氧化物和氧自由基等，維持正常新陳代謝[38-39]。在本試驗(yàn)中，處理15 d 時(shí)，SOD、CAT、POD 含量均出現(xiàn)一個(gè)增長(zhǎng)小峰，可能是杉木幼苗適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液濃度，活性氧增加、保護(hù)酶被防御系統(tǒng)激活所致。處理后期SOD、POD 活性均穩(wěn)步提升，M2的SOD、POD 活性提高尤為顯著，可見(jiàn)M2處理的杉木幼苗更快適應(yīng)環(huán)境的變化，并迅速激活自身保護(hù)酶體系，消除外界環(huán)境變化對(duì)自身結(jié)構(gòu)和代謝造成的破壞。這與在玉米[40]、桑樹(shù)[41]等植物上的研究結(jié)果一致。

鎂是葉綠素的組成成分，對(duì)維持葉綠素的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用。葉綠素含量是反應(yīng)葉片光合作用的一個(gè)重要指示，對(duì)光能的吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[42]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在處理前15 d 時(shí)，各處理間Cha、Chb、Chl 的含量無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)樘幚砬捌谏寄居酌缱陨淼膽?yīng)激系統(tǒng)和酶系統(tǒng)使代謝維持在較穩(wěn)定的水平，處理前期的差異并未達(dá)到顯著水平。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，處理30 d后，M0與M2出現(xiàn)顯著差異，M1、M3與M0之間存在差異但未達(dá)到顯著水平。由此可見(jiàn)，M2的鎂濃度更有利于杉木幼苗生長(zhǎng)發(fā)育。在王芳[36]的鎂對(duì)大豆葉綠素含量的研究中表明，適量施鎂使葉綠素的含量增加，有利于葉片光能吸收，光合能力增強(qiáng)，有機(jī)物累積。杉木幼苗Cha、Chb、Chl 的含量在整個(gè)處理時(shí)期均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，可能是由于本試驗(yàn)中不同程度供鎂條件和其他營(yíng)養(yǎng)元素的供給，各元素之間存在協(xié)同和代償作用，使葉綠素含量呈現(xiàn)穩(wěn)步緩慢上升的趨勢(shì)。

MDA 作為衡量植物受脅迫程度的一個(gè)重要指標(biāo)，常和CAT、POD、SOD 等抗氧化酶活性共同測(cè)量分析，以此確定植物受脅迫程度以及對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性和抗逆性[31]。本試驗(yàn)在供鎂基礎(chǔ)上研究較佳鎂配比營(yíng)養(yǎng)液，結(jié)果表明MDA 含量與SOD、CAT 活性均無(wú)顯著相關(guān)性，與POD 在0.05 水平顯著負(fù)相關(guān)，這與汪鳳林[25]的試驗(yàn)研究結(jié)果不相符?？赡苡袃煞矫娴脑?，一是MDA 含量增加的機(jī)制和SOD、CAT 活性調(diào)節(jié)機(jī)制無(wú)關(guān)；二是杉木幼苗在一定供鎂水平之上，MDA 含量和SOD、CAT 活性存在其他的代謝機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。SOD、POD 活性與Cha、Chb、Chl 均呈極顯著正相關(guān)，且SOD 活性與POD 活性呈極顯著正相關(guān)，這說(shuō)明POD、SOD 活性對(duì)葉綠素的合成有至關(guān)重要的作用，可能是為葉綠素合成提供一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境和保護(hù)作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的有序運(yùn)輸，其中的運(yùn)作機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

在不同配比的鎂營(yíng)養(yǎng)液中，杉木幼苗處理前30 d，各生理指標(biāo)無(wú)明顯規(guī)律，且差異未達(dá)到顯著水平。在處理30～45 d時(shí)，處理間差異逐漸明顯。研究結(jié)果表明，0.4 mmol/L的鎂溶液對(duì)杉木幼苗的生長(zhǎng)和發(fā)育具有較顯著的促進(jìn)作用，MDA 含量最低，POD、SOD 活性顯著高于其他處理，Cha、Chb、Chl含量最高。由此可見(jiàn)，此濃度的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)杉木幼苗葉片的損傷最小，最利于幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。