集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脫羧酶的原核表達(dá)分析

張 偉，劉志文＊，王小琴，李至敏，謝琮琮，李志敏*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何獲得高純度且保持活性的目的蛋白是深入研究生命活動(dòng)的關(guān)鍵問題[1]。由于微生物操作簡單、繁殖速度快等巨大優(yōu)勢，采用微生物生產(chǎn)活性蛋白的方法已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[2]。其中采用微生物進(jìn)行異源表達(dá)重組蛋白是常用的手段，目前表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)可以分為細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、單細(xì)胞藻類、桿狀病毒、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，具體選擇何種細(xì)胞來進(jìn)行異源表達(dá)取決于目的蛋白[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前發(fā)展最為完善也是最常用的高效異源表達(dá)重組蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)[4]。Page 等[5]研究了在大腸桿菌中以最經(jīng)濟(jì)的方式實(shí)現(xiàn)最大化表達(dá)異源蛋白的策略。Ceccarelli 等[6]綜述了大腸桿菌異源表達(dá)重組蛋白的諸多方案和面臨的挑戰(zhàn)。然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也存在諸多缺點(diǎn)。例如，利用大腸桿菌異源表達(dá)真核生物來源的蛋白時(shí)不能進(jìn)行翻譯后修飾，不能充分形成二硫鍵導(dǎo)致無法獲得可溶性蛋白等。因此很多在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功異源表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在。為了提高重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性，研究人員開發(fā)了多種助溶標(biāo)簽，如硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）及小分子泛素樣修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）等[7-10]。其中一些標(biāo)簽還有助于重組蛋白的分離純化。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)DnaK、DnaJ、GrpE、GroES、GroEL、tig 等分子伴侶蛋白可以幫助新生蛋白質(zhì)組裝和正確折疊，從而提高重組蛋白可溶性，甚至提高其穩(wěn)定性和活性[11-13]。【本研究切入點(diǎn)】α-酮戊二酸脫羧酶（α-KGD，EC 4.1.1.71）催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫氫酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸從而進(jìn)入三羧酸循環(huán)。由于藍(lán)細(xì)菌中缺乏α-酮戊二酸脫氫酶，因此α-KGD 就成了藍(lán)細(xì)菌三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶之一[14]。目前關(guān)于α-KGD的研究非常少，最新研究也僅停留在催化動(dòng)力學(xué)上，其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系和催化機(jī)制研究均未有報(bào)道[15]。本課題組發(fā)現(xiàn)多種藍(lán)細(xì)菌來源的α-KGD 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)后在裂解液上清中的可溶性不高，主要以包涵體的形式存在于沉淀中，非常難以獲得大量的可溶性α-KGD，這可能是造成目前未有研究報(bào)道有關(guān)α-KGD 的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及催化機(jī)制的重要原因之一。【擬解決的關(guān)鍵問題】在NCBI 數(shù)據(jù)庫中集胞藻PCC6803 中的sll1981基因被標(biāo)注為編碼乙酰乳酸合成酶。然而本課題組通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)sll1981基因編碼蛋白和聚球藻PCC7002 中的a2770基因編碼蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)到80%。聚球藻PCC7002 中的a2770 蛋白已被證實(shí)為一個(gè)α-KGD[14]。為了闡明集胞藻PCC6803 中的sll1981基因編碼蛋白的功能，首先就要獲得可溶性的重組sll1981 蛋白。因此本試驗(yàn)以來自集胞藻PCC6803 中的sll1981基因編碼蛋白為研究對象，構(gòu)建了含有sll1981基因的多種表達(dá)載體，探索了這些表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和可溶性情況，并比較不同方法表達(dá)后分離純化得到的sll1981 蛋白催化活性。動(dòng)力學(xué)測試表明集胞藻PCC6803 中sll1981基因編碼蛋白為α-KGD。本研究為在大腸桿菌中異源表達(dá)α-KGD 提供了重要信息，也將有助于該酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及催化機(jī)制的進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 集胞藻PCC6803 基因組DNA、pET-28b 質(zhì)粒、pET-32a 質(zhì)粒、pCold-TF 質(zhì)粒和分子伴侶pTf16質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶、DNA Marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×PfuPCR Master-Mix、質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PageRuler 預(yù)染蛋白Ladder 購于ThermoFisher Scientific 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI 和NdeI 購自NEW ENGLAND BioLabs；牛凝血酶（Thrombin）購于Sigma-Aldrich公司；Ni-NTA Agarose 購自QIAGEN公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購于北京索萊寶生物科技有限公司；魚腥藻PCC7120來源的琥珀酸半醛脫氫酶（ApSSADH）由本實(shí)驗(yàn)室純化。

1.2 PCR擴(kuò)增sll1981基因

以集胞藻PCC6803 基因組DNA 為模板擴(kuò)增sll1981基因，使用ApE 軟件設(shè)計(jì)上游引物sll1981-F（AAATTTGGATCCATGGGGCAAATGAACACCGCAG）和下游引物sll1981-R（AATAATCTCGAGTTATT CCCAAATTTCACAGGCC）（序列中下劃線為相應(yīng)酶切位點(diǎn)）。反應(yīng)體系包含基因組1 μL（終濃度為30 ng/μL），sll1981-F 和sll1981-R 各1μL（終濃度為0.2μmol/L），2×PfuPCR MasterMix 為25μL，加超純水22μL 至總體積50μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[16]。PCR 反應(yīng)結(jié)束后得到的產(chǎn)物經(jīng)1.5%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠純化PCR產(chǎn)物。

1.3 含有sll1981基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

回收得到的30μL PCR 產(chǎn)物中加入10×buffer 5μL，NdeI 和XhoI 限制性內(nèi)切酶各1μL，置于37 ℃水浴恒溫酶切1 h。同理，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對pET-28b載體進(jìn)行消化。膠回收酶切片段后用T4 DNA連接酶于16 ℃恒溫水浴下過夜連接（目的片段與載體片段的摩爾比為9∶1）。次日取連接液10μL 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，然后再涂布于卡那霉素抗性平板上篩選，次日挑取單克隆菌落做PCR鑒定和DNA 測序鑒定。將測序正確的質(zhì)粒保存為pET28b-sll1981質(zhì)粒。用同樣的方法構(gòu)建pET32asll1981質(zhì)粒和pColdTF-sll1981質(zhì)粒。

1.4 重組sll1981蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1.4.1 重組sll1981蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的單克隆菌落于含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，次日按體積分?jǐn)?shù)1%（v/v）接種量加入新鮮LB培養(yǎng)液中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8 時(shí)立即冰水浴30 min，然后加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑于16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。次日以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心收集菌體，得到的菌體用20 mmol/L pH 7.5 的Tris-HCl 緩沖液重懸，隨后置于冰水浴中超聲破碎（變幅桿Φ 為10 mm，超聲工作2 s，間歇8 s，有效功率10%（W/W），工作總時(shí)間5 min）。細(xì)胞破碎液于4 ℃、12 000 r/min離心30 min得到上清液和沉淀，最后電泳檢測sll1981蛋白表達(dá)情況。

1.4.2 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 采用上述方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，在加入0.2 mmol/L IPTG 后，將菌體分別置于16 ℃、20 ℃和25 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h，最后電泳檢測sll1981 蛋白表達(dá)情況。

1.4.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 采用上述同樣的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，加入0.2 mmol/L IPTG 后將菌體置于16 ℃、180 r/min 的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中分別誘導(dǎo)表達(dá)6，12，24 h，最后電泳檢測sll1981蛋白表達(dá)情況。

1.4.4 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 采用上述同樣的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，在菌體OD600至0.6～0.8 時(shí)分別加入終濃度為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 和1.0 mmol/L 的IPTG，然后將菌體均置于16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h，最后電泳檢測sll1981蛋白表達(dá)情況。

1.4.5 溶氧量的優(yōu)化 將轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的菌體過夜培養(yǎng)液分別接種于含有100，200，300，400 mL新鮮LB培養(yǎng)液的1 L錐形瓶中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8時(shí)，立即冰水浴30 min，再向其中加入0.2 mmol/L IPTG，置于16 ℃、180 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h，最后電泳檢測sll1981 蛋白表達(dá)情況。

1.5 重組sll1981蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981表達(dá)質(zhì)粒和pET-28b 對照質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞分別于含有50μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中恒溫過夜培養(yǎng)。次日，用4 個(gè)滅菌處理后的離心管分別離心收集體積分?jǐn)?shù)1%接種量的菌體，接著用自誘導(dǎo)培養(yǎng)液重懸收集的細(xì)胞，再將細(xì)胞接種至100 mL 含有100μg/mL卡那霉素的新鮮自誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，自誘導(dǎo)培養(yǎng)液按照文獻(xiàn)配置[17]。然后將上述菌體置于16 ℃、180 r/min條件下分別自誘導(dǎo)表達(dá)16，20和24 h。最后電泳檢測自誘導(dǎo)表達(dá)sll1981蛋白情況。后文將用此法獲得的sll1981蛋白標(biāo)注為Auto-sll1981。

1.6 重組sll1981蛋白與分子伴侶pTf16質(zhì)粒共表達(dá)

采用CaCl2法制得轉(zhuǎn)化有分子伴侶質(zhì)粒pTf16 的大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，再將pET28bsll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌落加入到同時(shí)含有50μg/mL 卡那霉素和25μg/mL 氯霉素的LB 培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。次日按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至含終濃度為1 mg/mL L-（+）-阿拉伯糖的新鮮LB 液體培養(yǎng)基（含上述相應(yīng)濃度抗生素）中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600約為0.8 時(shí)冰水浴冷卻30 min，然后加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，置于16 ℃、180 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。最后電泳檢測分子伴侶tig蛋白與sll1981蛋白共表達(dá)情況。后文將用此法獲得的sll1981蛋白標(biāo)注為Co-sll1981。

1.7 不同表達(dá)質(zhì)粒上sll1981蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述構(gòu)建成功的pET28b-sll1981、pET32a-sll1981和pColdTF-sll19813 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落分別于含50μg/mL 卡那霉素、100μg/mL 氨芐青霉素和100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。次日按體積分?jǐn)?shù)1%接種量分別加入100 mL新鮮LB培養(yǎng)液（含上述相應(yīng)濃度抗生素）中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8時(shí)立即冰水浴30 min，然后向其中加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，于16 ℃、180 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。最后電泳檢測sll1981 蛋白表達(dá)情況。后文分別標(biāo)注為sll1981、Trx-sll1981和TF-sll1981。

1.8 重組sll1981蛋白的分離純化

利用鎳親和層析的方法對上述sll1981 蛋白、Auto-sll1981 蛋白、Co-sll1981 蛋白、Trx-sll1981 蛋白和TF-sll1981 蛋白進(jìn)行分離純化。以純化Auto-sll1981 蛋白為例。超聲波破碎細(xì)胞后于4 ℃、12 000 r/min條件下離心1 h，得到的上清液用0.45μm濾膜過濾后流穿經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液平衡后的Ni-NTA柱，然后用含20～200 mmol/L咪唑的20 mM Tris-HCl，pH 7.5緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集不同濃度下的流穿液并電泳檢測。合并高濃度高純度sll1981 蛋白的洗脫液后于4 ℃濃縮（PEG 20 000）脫鹽（透析3 次）處理，得到的sll1981 蛋白直接用于酶活測定。采用相同的方法純化另外3 種sll1981 蛋白。另外，取純化得到的部分TF-sll1981 蛋白于4 ℃經(jīng)牛凝血酶酶切4 h，然后重新流穿平衡后的Ni-NTA 柱以除去標(biāo)簽，最后得到無TF標(biāo)簽的sll1981蛋白。通過測量蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度，計(jì)算出無TF標(biāo)簽的sll1981蛋白（ε=58 955 L/（mol·cm））和TF-sll1981蛋白的濃度（ε=35 995 L/（mol·cm））。

1.9 重組sll1981蛋白的活性檢測

以α-酮戊二酸（α-KG）為底物，采用酶偶聯(lián)法分別檢測自誘導(dǎo)表達(dá)后純化得到的sll1981蛋白、與分子伴侶pTf16質(zhì)粒共表達(dá)后純化得到的sll1981蛋白、帶TF標(biāo)簽的sll1981蛋白以及無TF標(biāo)簽的sll1981蛋白的活性[18]。500μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中包含100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液，2 mmol/L Mg2+，2 mmol/L焦磷酸硫胺素（TPP），2 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+），α-KG 濃度為2～30 mmol/L，9μmol/L 來源于魚腥藻PCC7120 的琥珀酸半醛脫氫酶（ApSSADH）[19]，5μmol/L sll1981 蛋白。使用紫外分光光度計(jì)連續(xù)測定反應(yīng)混合液在340 nm 處的吸光值（A340）變化，并根據(jù)NADPH 的生成速率計(jì)算出加入不同濃度α-KG 時(shí)的初始速度。運(yùn)用KaleidaGraph 4.0 軟件繪制動(dòng)力學(xué)曲線，并根據(jù)米氏方程v=vmax·[S]/（Km+[S]）計(jì)算出Km和kcat。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得一條位于1.5～2.0 kbp，大小約1.7 kbp 的DNA 條帶（圖1A）。該基因片段與sll1981基因理論大?。? 653 bp）相吻合。將該擴(kuò)增得到的sll1981基因酶切后和用相應(yīng)酶切后的pET-28b 載體按比例連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，次日隨機(jī)挑取7 個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定。如圖1B可知，3、4、5、7和8號條帶為陽性克隆，2和6號條帶為假陽性克隆。選取其中3 個(gè)陽性克隆點(diǎn)送由上海祥音生物科技有限公司進(jìn)行DNA 測序，測序結(jié)果經(jīng)ApE 軟件分析證明PCR 擴(kuò)增獲得到的sll1981基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的sll1981基因序列完全一致。因此，成功構(gòu)建得到pET28b-sll1981表達(dá)菌株。

圖1 集胞藻PCC6803的sll1981基因PCR擴(kuò)增和菌落PCR鑒定Fig.1 Amplification and clone identification of sll1981 gene from Synechocystis sp.PCC6803

2.2 重組sll1981蛋白的表達(dá)條件的優(yōu)化

重組pET28b-sll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在0.2 mmol/L IPTG，16 ℃、180 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h后的結(jié)果如圖2所示。和空載體表達(dá)情況比較發(fā)現(xiàn)，pET28b-sll1981表達(dá)菌株在該條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)大量sll1981 蛋白，然而誘導(dǎo)表達(dá)的sll1981 蛋白在裂解緩沖液中基本不可溶。隨后，本研究探索了各項(xiàng)誘導(dǎo)表達(dá)條件，以期找到最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，方便后續(xù)蛋白純化以及活性測試。

首先探索了誘導(dǎo)溫度的影響，結(jié)果如圖3 所示。重組sll1981 蛋白在16 ℃、20 ℃和25 ℃下表達(dá)量均很高，然而在裂解緩沖液中的可溶性很差，低溫并沒有改善其可溶性。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)溫度為20 ℃和25 ℃時(shí)，重組sll1981蛋白的表達(dá)量比16 ℃時(shí)稍高。

其次探索了誘導(dǎo)時(shí)間的影響，其表達(dá)結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可知誘導(dǎo)相對較長時(shí)間（24 h）可以顯著提高sll1981 蛋白的表達(dá)量，誘導(dǎo)時(shí)間過短（6 h）會使得sll1981 蛋白表達(dá)量大大減少，然而誘導(dǎo)時(shí)間并不影響sll1981 蛋白的可溶性。本研究還探索了IPTG 濃度的影響。如圖4B 所示，當(dāng)不添加IPTG 時(shí)，sll1981 蛋白沒有表達(dá)。當(dāng)添加IPTG 濃度在0.02～1 mmol/L 時(shí)，sll1981 蛋白的表達(dá)量沒有明顯差別。在此條件表達(dá)時(shí)，重組sll1981蛋白沒有明顯的可溶性。此外本研究還探索了培養(yǎng)液的溶氧量對sll1981蛋白表達(dá)和可溶性的影響。其誘導(dǎo)表達(dá)情況如圖4C。研究發(fā)現(xiàn)，溶氧量的改變并沒有顯著影響sll1981蛋白的表達(dá)量和可溶性。

2.3 其他含有sll1981基因重組質(zhì)粒的表達(dá)

在大腸桿菌中自誘導(dǎo)表達(dá)外源基因獲得重組蛋白的方法簡便易操作，因此本研究也探索了自誘導(dǎo)表達(dá)方式對pET28b-sll1981重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)重組sll1981 蛋白的影響。結(jié)果表明，在16 ℃時(shí)自誘導(dǎo)16 h沒有誘導(dǎo)表達(dá)sll1981蛋白，自誘導(dǎo)20 h后該菌株表達(dá)了非常少量的sll1981蛋白。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)24 h 后sll1981 蛋白被大量表達(dá)。因此，采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基也能有效表達(dá)重組sll1981 蛋白，然而此方法表達(dá)的sll1981 蛋白可溶性并沒有顯著提高（圖5A）。此前研究表明過表達(dá)分子伴侶蛋白可以促進(jìn)目的蛋白的折疊，從而提高重組蛋白的可溶性。本研究采用pET28b-sll1981重組質(zhì)粒與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)sll1981蛋白的方式，其結(jié)果如圖5B所示。分子伴侶質(zhì)粒pTf16表達(dá)的觸發(fā)因子tig 蛋白大小為56 ku，比目的蛋白sll1981 小，與電泳結(jié)果中顯示的tig 蛋白處于sll1981 蛋白下方一致，下圖接近55 ku的蛋白分子即為觸發(fā)因子tig蛋白。由圖5B可知，與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共表達(dá)可以顯著提高sll1981 蛋白的可溶性。同時(shí)筆者也構(gòu)建了pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981重組質(zhì)粒，其分別含有可能提高重組蛋白可溶性的Trx 和觸發(fā)因子TF 標(biāo)簽。研究結(jié)果表明sll1981 蛋白連接Trx 標(biāo)簽后其可溶性沒有顯著提高，然而sll1981 蛋白連接TF 標(biāo)簽后其可溶性顯著提高，表達(dá)的sll1981 蛋白基本都在上清中（圖5C）。

圖2 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 The induced expression of recombinant sll1981 protein in Escherichia coli

圖3 不同溫度下重組sll1981蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Induced expression of recombinant sll1981 protein at deferent temperatures

圖4 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒在不同條件下的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 The expression of recombinant pET28b-sll1981 plasmid at various conditions

圖5 重組sll1981蛋白的表達(dá)情況Fig.5 The expression of recombinant sll1981 protein at various vectors

2.4 重組sll1981蛋白的純化

分別對上述自誘導(dǎo)（Auto-sll1981）、與pTf16 共表達(dá)（Co-sll1981）和TF-sll1981 融合表達(dá)（TFsll1981）方法表達(dá)的重組sll1981蛋白進(jìn)行分離純化。此前研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)純化IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的sll1981蛋白時(shí)，洗出的重組sll1981容易形成白色渾濁沉淀，因此最終未能純化得到sll1981蛋白。隨后嘗試對Autosll1981 蛋白進(jìn)行分離純化（圖6A），最終得到濃度為10μmol/L 的sll1981 蛋白（圖6B）。純化過程未見明顯白色渾濁，可推測自誘導(dǎo)表達(dá)的sll1981 蛋白相對較穩(wěn)定。對Auto-sll1981 濃縮時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Auto-sll1981濃度超過10μmol/L時(shí)該蛋白還是會聚集形成白色沉淀。對Co-sll1981蛋白進(jìn)行分離純化（圖7A），最終得到濃度為30μmol/L的sll1981蛋白（圖7B）。采用與pTf16質(zhì)粒共表達(dá)后純化得到的Co-sll1981蛋白濃度明顯高于自誘導(dǎo)表達(dá)后純化得到的Auto-sll1981蛋白濃度，由此推測Co-sll1981蛋白較上述兩種方法表達(dá)的sll1981蛋白更加穩(wěn)定。

圖6 自誘導(dǎo)表達(dá)sll1981蛋白的純化Fig.6 Purification of auto-induced expression of recombinant sll1981 protein

圖7 與pTf16分子伴侶共表達(dá)sll1981蛋白的純化Fig.7 Purification of sll1981 protein co-expressed with chaperone plasmid pTf16

重組TF-sll1981 蛋白的純化如圖8 所示。由于得到的TF-sll1981 蛋白帶有分子量較大的TF 標(biāo)簽，因此將TF-sll1981 蛋白于4 ℃經(jīng)凝血酶酶切后再次流穿Ni-NTA 親和層析柱后使得sll1981 蛋白與TF 標(biāo)簽蛋白分離，得到無TF標(biāo)簽的高純度sll1981蛋白（圖8B）。

圖8 與TF標(biāo)簽融合表達(dá)sll1981蛋白的純化結(jié)果Fig.8 Purification of sll1981 protein expressed with TF tag

2.5 重組sll1981蛋白作為α-KGD的活性比較

由于sll1981蛋白非常不穩(wěn)定，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的sll1981蛋白在用咪唑梯度洗脫時(shí)已經(jīng)形成白色沉淀，因此無法檢測其催化活性。其他方法純化得到的sll1981蛋白均能檢測出α-KGD活性（表1）。研究結(jié)果表明催化活性最高的sll1981蛋白是采用與pTf16質(zhì)粒共表達(dá)的Co-sll1981蛋白，其次為Auto-sll1981蛋白，活性最低的是TF-sll1981蛋白。當(dāng)TF-sll1981蛋白的TF標(biāo)簽被酶切后，盡管筆者可以純化得到不帶TF標(biāo)簽的sll1981蛋白，然而在測定活性的緩沖液體系中該不帶TF標(biāo)簽的sll1981蛋白極易沉淀，因此無法測定其催化活性。當(dāng)?shù)孜铴?KG濃度超過6 mmol/L時(shí)，采用自誘導(dǎo)方式獲得的Auto-sll1981在活性測定緩沖體系中也易沉淀，因此本試驗(yàn)僅能測定其在底物濃度為6 mmol/L時(shí)的反應(yīng)速度為0.670μmol/（L·s），無法測得其他動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

表1 不同方法表達(dá)的重組sll1981蛋白活性比較Tab.1 Activity comparison of recombinant sll1981 protein expressed by different methods

3 討論與結(jié)論

此前研究表明菌株、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度及誘導(dǎo)時(shí)間均會影響重組蛋白在異源表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量和可溶性。例如，Biria 研究組[20]通過taguchi 法優(yōu)化誘導(dǎo)溫度和時(shí)間及培養(yǎng)基配方大大提高了人類生長激素蛋白（hGH）在大腸桿菌Origami 菌株中的產(chǎn)率。Xu 等[21]通過優(yōu)化IPTG 濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，使得重組疏水蛋白（HGFI）在大腸桿菌BL21 菌株中得到了滿意的表達(dá)。本研究比較了pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中不同溫度，IPTG 濃度及誘導(dǎo)時(shí)間、不同溶氧體積比及自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)重組sll1981 蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中表達(dá)量很高，然而基本都是以包涵體形式存在。通過與Trx 助溶標(biāo)簽融合表達(dá)的方式也無助于提高sll1981 蛋白的可溶性。盡管與pColdTF 質(zhì)粒中TF 標(biāo)簽融合表達(dá)后提高了sll1981 蛋白的可溶性，但是酶切TF 標(biāo)簽蛋白后sll1981 蛋白非常不穩(wěn)定，因此與TF 標(biāo)簽融合表達(dá)這種方法也不可行。幸運(yùn)的是通過與pTf16 分子伴侶質(zhì)粒共表達(dá)的方式獲得了可溶性的sll1981 蛋白，并且具有較高的催化α-KG 脫羧生成琥珀酸半醛的活性。本研究數(shù)據(jù)為生產(chǎn)可溶性具有催化活性的sll1981 蛋白質(zhì)提供了重要基礎(chǔ)。事實(shí)上，2006 年Chatterjee 等人發(fā)現(xiàn)pET21b-sll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 菌株后表達(dá)的sll1981 蛋白也是以包涵體形式存在，該作者通過包涵體復(fù)性的方法純化得到sll1981 蛋白，但是用此法獲得的sll1981 沒有α-KGD 活性[22]。本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)與sll1981 蛋白氨基酸序列高度一致的其他藍(lán)細(xì)菌來源的α-KGD 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性均很差，因此本研究結(jié)果對于純化其他來源的α-KGD 也有重要的參考意義。

此前研究指出自誘導(dǎo)培養(yǎng)基較普通LB 培養(yǎng)基具有均勻的高細(xì)胞培養(yǎng)密度和較強(qiáng)的表達(dá)能力[23]。因此，本研究嘗試了自誘導(dǎo)培養(yǎng)基表達(dá)重組sll1981 蛋白。SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)表達(dá)的sll1981蛋白有少量存在于上清液中，繼而對該方法表達(dá)的sll1981 蛋白進(jìn)行純化以及活性測試。在純化過程中，洗出的sll1981 蛋白并沒有形成沉淀，最終純化得到濃度為10 μmol/L 的sll1981 蛋白，超過此濃度時(shí)蛋白極易發(fā)生沉淀。在測定該法獲得的sll1981 蛋白活性時(shí)，最高僅能檢測到底物α-KG 濃度為6 mmol/L，當(dāng)超過該濃度時(shí)，sll1981 蛋白會聚集形成白色渾濁。猜想可能的原因有二。其一，當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃髸r(shí)，反應(yīng)液中離子強(qiáng)度發(fā)生改變促使sll1981 蛋白構(gòu)象由穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)向不穩(wěn)定狀態(tài)；其二，α-KG 含有兩個(gè)羧基，當(dāng)加入更高濃度的α-KG 時(shí)，反應(yīng)液的pH 值有所改變，致使sll1981 蛋白逐漸形成白色沉淀。

分子伴侶蛋白有助于防止新生蛋白在細(xì)胞擁擠的環(huán)境中發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集[24]。其中觸發(fā)因子TF（伴侶蛋白）會與核糖體1:1 結(jié)合，并與新生蛋白鏈相互作用，使其處于可進(jìn)行后續(xù)折疊的狀態(tài)[25-26]。因此本研究選用pTf16 分子伴侶質(zhì)粒（表達(dá)的伴侶蛋白為TF）與pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達(dá)，結(jié)果得到大量可溶性sll1981 蛋白，并且純化得到較高濃度的sll1981 蛋白（30 μmol/L）。該結(jié)果說明在此濃度下sll1981 蛋白不會聚集形成沉淀，比自誘導(dǎo)表達(dá)的sll1981 蛋白更穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌硫氧還蛋白Trx 和觸發(fā)因子TF 在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中可以防止初生蛋白錯(cuò)誤折疊和聚集，使得多亞基蛋白不易形成包涵體，從而有效提高蛋白質(zhì)的溶解性，因而開發(fā)了目的蛋白與標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)的方法。本研究構(gòu)建了兩種融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981。結(jié)果顯示sll1981蛋白與Trx 融合表達(dá)后溶解性并沒有顯著變化，而與TF 標(biāo)簽融合表達(dá)后的溶解性顯著提高，并且純化得到更高濃度的sll1981 蛋白（30 μmol/L）。遺憾的是TF-sll1981 蛋白酶切去TF 標(biāo)簽后獲得的sll1981蛋白同樣不穩(wěn)定。

本研究探索了不同表達(dá)條件和表達(dá)方法對集胞藻PCC6803來源的sll1981蛋白表達(dá)量和可溶性的影響，最后純化得到具有催化活性的重組sll1981 蛋白。酶動(dòng)力學(xué)測試數(shù)據(jù)表明sll1981 蛋白具有α-KGD活性，并且不同表達(dá)方法獲得的sll1981 蛋白的催化活性差異較大，其中當(dāng)pET28b-sll1981質(zhì)粒與pTf16分子伴侶質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達(dá)時(shí)，重組sll1981蛋白的可溶性和催化活性均為最佳。