慢病毒介導穩(wěn)定表達禽β-防御素9的DF-1細胞系的建立及初步應(yīng)用

熊修琦，耿 姝，李芳果，殷冬冬，薛 媚，邵 穎，涂 健，宋祥軍，祁克宗

（獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036）

【研究意義】近年來，我國養(yǎng)殖業(yè)抗生素的濫用不僅造成致病菌耐藥性的產(chǎn)生，增大獸醫(yī)臨床用藥的難度，而且造成畜禽產(chǎn)品藥物殘留超標，危害人類健康[1]。因此，研究能夠代替抗生素的無污染、無殘留及無毒副作用的新型抗菌制劑已成為畜牧業(yè)亟待解決的重要問題[2]?！厩叭搜芯窟M展】禽防御素（AvBDs）屬于β-防御素，是一類在禽體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性陽離子短肽[3-7]。由于禽類異噬性細胞缺乏氧化機制，AvBDs 構(gòu)成的非氧化機制在禽類機體的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[8]。研究表明，AvBDs 能夠有效抑制細菌、真菌、原生生物、病毒等病原體，具有廣譜抗微生物活性[9-10]，且因其特殊抗菌機制，不易產(chǎn)出耐藥性[11-12]，因而AvBDs 具有潛在的臨床應(yīng)用價值。AvBD9 具有很強的抗微生物活性，能夠殺滅大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、空腸彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和白色念珠菌等多種微生物[13]?！颈狙芯壳腥朦c】AvBD9 在機體表達量低，提取天然AvBD9 操作繁瑣，提取率較低；化學合成成本高，不適合臨床生產(chǎn)使用[14]；原核表達方式操作簡便，但易形成無生物學活性的包涵體，限制了AvBDs的生產(chǎn)與研究[15]，因此，可以通過建立穩(wěn)定表達AvBD9 的細胞系彌補上述缺點，同時也是制備具有生物活性AvBD9 的有效途徑之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用慢病毒表達載體系統(tǒng)，構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pLOV-eGFPAvBD9，通過轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝慢病毒，并將重組慢病毒感染DF-1細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達AvBD9 的DF-1 細胞系，并用其產(chǎn)物培養(yǎng)耐藥大腸桿菌，檢測其抗菌活性。該細胞系的建立為抗生素替代品的生產(chǎn)制備提供了新思路，同時也為進一步開展AvBD9相關(guān)的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與細胞

DH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程（大連）有限公司；慢病毒系統(tǒng)pLOV-CMV-eGFP-EF1a-PuroR、psPAX2和pMD2.G載體質(zhì)粒、pET-32a-AvBD9質(zhì)粒以及293T細胞和DF-1細胞均由本實驗室保存；耐藥禽致病性大腸桿菌由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室分離鑒定。

1.2 主要試劑

ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Lipofectamine2000 購自Invitrogen 公司；嘌呤霉素、ECL 發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；HRP 標記的兔抗鼠IgG購自武漢博士德公司；AvBD9多克隆抗體血清由本實驗室制備。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)Genbank 發(fā)表的雞源AvBD9基因序列（登錄號NM_001001611）和同源重組酶設(shè)計原則（下劃線為同源臂序列），引物序列見表1。

1.4 重組表達質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD9的構(gòu)建

以實驗室保存的pET-32a-AvBD9質(zhì)粒為模板，pLOV-AvBD9-F/R為引物，擴增含有同源臂的AvBD9成熟肽基因，PCR 程序為98 ℃10 s；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃20 s（循環(huán)35 次）；72 ℃10 min。以pLOVCMV-eGFP-EF1a-PuroR 載體為模板，pLOV-F/R 為引物，擴增載體使其線性化，PCR 程序為98 ℃10 s；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃9 min（循環(huán)35次）；72 ℃10 min。將擴增的含有同源臂的AvBD9基因的PCR產(chǎn)物與pLOV-eGFP 線性化產(chǎn)物進行凝膠電泳，并膠回收，按照ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 操作說明將產(chǎn)物進行同源重組。將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，挑取PCR 鑒定陽性菌液送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pLOV-eGFP-AvBD9。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 慢病毒的包裝

使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒分別提取重組質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD9、包裝質(zhì)粒psPAX2 和外膜質(zhì)粒pMD2.G。將293T 細胞接種至10 cm 培養(yǎng)皿，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，當細胞密度達到90%時，按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將25 μg pLOV-eGFP-AvBD9 重組質(zhì)粒、15μg 包裝質(zhì)粒psPAX2 和15μg 外膜質(zhì)粒pMD2.G 共轉(zhuǎn)染293T 細胞，6 h后更換細胞培養(yǎng)液，48 h 后收集細胞上清即為AvBD9 慢病毒上清，4 ℃保存?zhèn)溆?。同時以轉(zhuǎn)染空載體pLOV-eGFP、pSPAX2 和pMD2.G 質(zhì)粒包裝的慢病毒感染的DF-1 細胞為陰性對照，正常的DF-1 細胞為空白對照。

1.6 嘌呤霉素工作濃度的確定

將DF-1細胞平鋪于6孔板中，至細胞培養(yǎng)密度達到90%時，更換分別添加1，2，3，4，5μg/mL濃度嘌呤霉素的細胞培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液，觀察細胞存活狀態(tài)，培養(yǎng)6～10 d后以細胞全部死亡的嘌呤霉素最低濃度為最佳篩選濃度。

1.7 表達AvBD9細胞系的構(gòu)建和篩選

待DF-1 細胞密度長至80%左右，用材料和方法1.5 中收集的上清液進行感染，感染24 h 后，重復(fù)感染1次。加入含工作濃度的嘌呤霉素的細胞培養(yǎng)液進行篩選，感染24 h后，用含重組病毒樣顆粒的上清液重復(fù)感染一次。第2次感染24 h后，使用含工作濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基進行篩選，每隔1 d棄去細胞培養(yǎng)上清液，更換含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。用含工作濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基連續(xù)傳5代進行加壓篩選，以得到穩(wěn)定表達的細胞系。

1.8 AvBD9基因組mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測

收集第20 代DF-1-pLOV-eGFP-AvBD9 細胞，用Trizol 法提取細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將細胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用引物AvBD9-F和AvBD9-R 進行PCR 擴增，PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時設(shè)置空白組和對照組。

1.9 DF-1-AvBD9細胞系傳代穩(wěn)定性檢測

收集DF-1-AvBD9細胞上清液5 mL，冷凍干燥濃縮后取50μL與SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%（v/v）脫脂奶粉封閉過夜，加入制備1:500 稀釋的AvBD9 抗體血清37 ℃孵育1 h，TBST 清洗3 次，10 min/次，加入HRP 標記的IgG 二抗，室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，10 min/次，最后利用ECL顯色。同時設(shè)置陰性對照和空白對照。

1.10 重組AvBD9抗藥活性檢測

收集穩(wěn)定表達AvBD9 細胞系和轉(zhuǎn)染空載體的不含抗生素的細胞培養(yǎng)上清液，分別設(shè)為試驗組和對照組。將培養(yǎng)的耐藥大腸桿菌菌數(shù)調(diào)整為1×104CFU/mL 組，之后分別取10μL 已定量的耐藥大腸桿菌菌液分別混入實驗組和對照組的培養(yǎng)液各200μL，不同時間37 ℃孵育后，用酶標儀在600 nm 波長下讀取吸光度。取試驗組吸光度與對照組吸光度的比值，將此比值做為耐藥大腸桿菌的存活率，每組實驗均重復(fù)3次，并統(tǒng)計分析。

將供試細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期并調(diào)整濃度為104CFU/mL，培養(yǎng)條件同上，并制備掃描電鏡樣品，將離心及PBS 清洗后的細菌置于2.5%戊二醛溶液中固定2 h，于乙醇中進行梯度脫水，每次10～15 min，脫水后的樣品浸泡在100%丙酮中進行真空干燥，然后進行黏臺，鍍金，用掃描電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體pLOV-eGFP-AvBD9的構(gòu)建

根據(jù)材料和方法1.4，擴增出8 521 bp的線性化的pLOV-eGFP 載體以及170 bp 的含有同源臂的AvBD9基因，條帶大小與預(yù)期相符（圖1）。菌液PCR 驗證為陽性的真核表達質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD9 克隆菌株測序結(jié)果表明，AvBD9基因未發(fā)生堿基突變、缺失或移碼。

圖1 pLOV-eGFP載體線性化以及含同源臂的AvBD9基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of linear amplification of pLOV-eGFP vector and PCR amplification product of AvBD9 gene containing homology arm

2.2 嘌呤霉素對MDBK細胞最小致死濃度測定

實驗結(jié)果表明，DF-1 細胞在更換不同濃度的嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，出現(xiàn)明顯的生長停滯。第3 天時DF-1 細胞大量死亡。當?shù)?0 天時，2，3，4，5μg/mL 組中DF-1 細胞均死亡，僅1μg/mL 組中有極少量DF-1 細胞存活。因此，確定嘌呤霉素對DF-1 細胞的最小致死濃度為1μg/mL，并將此濃度的嘌呤霉素作為篩選工作濃度。

2.3 表達AvBD9的DF-1細胞系構(gòu)建及篩選結(jié)果

根據(jù)材料和方法1.5，將pLOV-eGFP-AvBD9、pSPAX2和pMD2.G 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細胞，24 h后，熒光顯微鏡下觀察瞬時轉(zhuǎn)染后綠色熒光信號分布。取293T 細胞培養(yǎng)上清液感染DF-1 細胞，以1 μg/mL 嘌呤霉素工作濃度進行細胞篩選后得到細胞多克隆，通過3 輪有限稀釋法純化將穩(wěn)定表達AvBD9 的單細胞克隆擴大培養(yǎng)，獲得DF-1-AvBD9細胞系（圖2）。

2.4 細胞基因組中AvBD9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

提取第20 代DF-1-AvBD9 細胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用特異性引物AvBD9-F 和AvBD9-R 擴增AvBD9 基因。結(jié)果表明，RT-PCR 檢測第20 代DF-1-AvBD9 細胞能測出AvBD9基因，而陰性對照和空白對照中均未檢測出AvBD9基因（圖3），表明在DF-1-AvBD9細胞中AvBD9基因能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄成mRNA。

2.5 AvBD9蛋白在DF-1-AvBD9細胞系的表達

將DF-1-AvBD9 細胞傳代至第20 代，選取第20 代的DF-1-AvBD9 細胞系上清，進行Western Blot 檢測。Western Blot 結(jié)果顯示，DF-1-AvBD9 細胞上清中能夠檢測到AvBD9 蛋白，而空白組DF-1 細胞和對照組DF-1-pLOV-eGFP細胞中均未檢測出AvBD9蛋白（圖4）。

2.6 重組AvBD9抗藥活性檢測

細胞培養(yǎng)上清液與耐藥大腸桿菌作用不同時間后讀取吸光度，結(jié)果顯示：隨著孵育時間的增加，耐藥菌的存活率逐漸降低，孵育5 h 時多重耐藥大腸桿菌的存活率低于55%，但作用6 h 后，存活率開始上升（圖5）。表明AvBD9 的抗菌效果同時間具有相關(guān)性。同時，掃描電鏡檢測抑菌活性發(fā)現(xiàn)，對照組菌體完整飽滿，表面光滑。經(jīng)AvBD9作用6 h后的菌體干癟皺縮，變形扭曲，表面凹凸不平（圖6）。掃描電鏡顯示，AvBD9對供試細菌具有明顯的損傷作用。

圖2 慢病毒包裝及細胞系篩選結(jié)果圖Fig.2 Lentiviral packaging and cell line screening results

圖3 DF-1-AvBD9細胞AvBD9基因檢測Fig.3 Detection of AvBD9 gene in DF-1-AvBD9 cells

圖4 AvBD9蛋白Western blot檢測Fig.4 Western blot analysis of AvBD9 protein

圖5 DF-1-AvBD9細胞培養(yǎng)上清的抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of DF-1-AvBD9 cell culture supernatant

圖6 掃描電鏡檢測AvBD9抑菌效果Fig.6 Detection of the antibacterial effect of AvBD9 by scanning electron microscopy

3 結(jié)論與討論

防御素是一種富含半胱氨酸的陽離子肽，大多由20～200個氨基酸組成，能夠殺死多種病原體，包括各種細菌、真菌和某些病毒[9]。AvBDs廣泛分布于雞腸道、肝臟、肺臟、腎臟、卵巢、睪丸、胸腺、法氏囊、心臟等器官的組織細胞，在禽體中發(fā)揮著重要防御功能。目前，已有多種雞AvBDs在大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)中成功表達，如張開娟等[16]在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達了雞AvBD7，魏海婷等[17]在畢赤酵母中成功表達雞AvBD2，張永正[18]在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達雞AvBD9 等。大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)經(jīng)條件優(yōu)化能夠達到所需蛋白量，但易形成無生物學活性的包涵體，即便通過復(fù)性也難以恢復(fù)防御素的天然結(jié)構(gòu)，酵母表達載體存在產(chǎn)物酰胺化不完全影響活性以及AvBDs 易在表達及純化過程中降解等問題[19-20]。因此，建立一種能持續(xù)穩(wěn)定表達AvBDs的細胞系成為一種有效的選擇。

目前，目的基因?qū)爰毎卸喾N方法，但大部分方法不能將外源基因整合入基因組，且導入的目的基因容易在篩選后的傳代培養(yǎng)過程中發(fā)生丟失和突變[21]，而慢病毒載體可以將攜帶的外源基因?qū)胨拗骷毎?，通過反轉(zhuǎn)錄將目的基因整合進入細胞基因組，并穩(wěn)定表達，具有操作簡便、擴增周期短、轉(zhuǎn)染率高、能長期穩(wěn)定表達的特點，且能夠感染分裂和不分裂細胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細胞（如神經(jīng)細胞）[22-23]，使其在研究中被廣泛使用。因此，本研究選擇利用慢病毒載體系統(tǒng)制備穩(wěn)定表達AvBD9 的DF-1細胞系，提供穩(wěn)定的AvBD9蛋白來源，為克服細菌耐藥性和抗生素替代提供研究思路，也為今后研究AvBD9的生物學功能及其在抗病原微生物活性方面提供依據(jù)。