滇水金鳳CHI基因的克隆及表達(dá)分析

李 洋，黃武略，林福永，羅 超，李新藝，劉應(yīng)麗，朱佳鵬，馮志熙，黃美娟，黃海泉

（西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院/園林園藝花卉研發(fā)中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650224）

【研究意義】花色是園林植物重要的觀賞性狀，一直是育種工作者追求的重要目標(biāo)性狀[1]。植物的花色素在花色生成過程中占據(jù)著重要的地位，按特點(diǎn)主要分為生物堿（alkaloid）、類胡蘿卜素（carotenoid）和類黃酮（flavonoid）3種，其中類黃酮是存在于絕大多數(shù)植物中的一種酚類化合物，對花色形成的影響最為廣泛[2]。花色苷（anthocyanin）是類黃酮化合物的重要組成部分，在植物的各個部位均有分布[3-4]，與植物花、葉、果實(shí)的呈色息息相關(guān)[5-6]，在植物的防御與進(jìn)化進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。CHI基因是花色苷合成途徑中關(guān)鍵的酶基因，主要編碼查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI），在類黃酮化合物的合成中起著關(guān)鍵作用[7-8]。滇水金鳳（Impatiens uliginosa）是鳳仙花科（Balsaminaceae）鳳仙花屬（Impatiens）的一年生草本植物，主要分布在我國西南地區(qū)，多生于濕地淺水中，花開茂盛，抗性強(qiáng)，繁殖速度快，花形奇特，顏色絢麗，在園林上有一定的應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CHI基因先后從蕓豆（Phaseolus vulgaris）、金魚草（Antirrhinum majus）、矮牽牛（Petunia hybrida）等多種植物中分離出來用以研究其功能作用[9-15]，且已有大量通過改變CHI基因的表達(dá)以改變植物花色的報道，如抑制CHI基因的表達(dá)會使康乃馨（Dianthus caryophyllus）[16]、仙客來（Cyclamen persicum）[17]、煙草（Nicotiana tabacum）花瓣中查爾酮的含量上升，花色變黃[18]。趙芮等[19]首次從滇水金鳳中分離克隆出AGAMOUS基因研究其花型結(jié)構(gòu)及發(fā)育。黃奇等[20]通過對不同顏色滇水金鳳花瓣中金屬元素的含量進(jìn)行測定，探索了不同含量的金屬元素是否對滇水金鳳花色的形成具有影響[21-22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前對CHI基因的研究主要集中在查爾酮異構(gòu)酶的催化作用、類黃酮物質(zhì)水平的提高、花色代謝和園林植物的改良等[23-25]。迄今為止，國內(nèi)外對滇水金鳳花色變異的分子機(jī)理尚未見相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在克隆得到滇水金鳳CHI基因的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行序列分析和表達(dá)分析，為滇水金鳳花色形成的機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究鳳仙花屬植物的花色改良和新品種選育提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用植物材料為紅色和白色的野生滇水金鳳，采集于昆明市撈魚河濕地公園和阿子營。所用試劑材料主要有植物總RNA 提取試劑盒（百泰克）、膠回收試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金）、DH5α菌株（TIANGEN）、PMD18-TVector 連接載體（TAKARA）和熒光染料（翊圣）等。本試驗引物由昆明碩擎生物科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和CHI基因的克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別設(shè)計擴(kuò)增全長的特異性引物（表1）。

表1 滇水金鳳CHI基因cDNA序列擴(kuò)增引物Tab.1 Relevant primer sequences of CHI gene cDNA amplification in Iupatiens uliginosa

提取滇水金鳳花瓣總RNA，以RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 第一鏈作為模板進(jìn)行CHI基因全長cDNA擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：10×Easy Taq Buffer 2 μL，High Pure dNTPs 1.6 μL，MgCl20.4 μL，模板1 μL，引 物 各1 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，第一輪53 ℃退火30 s，第二輪58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2CHI基因序列分析 利用NCBI 的BLAST 功能找出與滇水金鳳CHI基因同源性高的各物種氨基酸序列，運(yùn)用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列同源性分析，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3CHI基因表達(dá)模式分析 分別取4 個花發(fā)育時期（花苞期、花苞開放期、盛花期和謝花期）（圖1）的白色和紅色滇水金鳳的花器官提取其RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈稀釋10倍用作qRT-PCR模板。設(shè)計qRT-PCR的引物（表2），內(nèi)參基因為IuActin。采用2 步法進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，每個樣品進(jìn)行3 個重復(fù)，將花蕾期定義為1 個單位作為對照，以2 種花色及4個時期作為橫坐標(biāo)，各基因的表達(dá)量作為縱坐標(biāo)建立坐標(biāo)軸，對目的基因在各個花色、各個時期的表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。

圖1 滇水金鳳白色花和紅色花的4個時期Fig.1 Four stages of white and red flowers of Impatiens uliginosa

表2 滇水金鳳CHI基因熒光定量特異引物Tab.2 Specific primer of Real-time PCR of CHI in Iupatiens uliginosa

2 結(jié)果與分析

2.1 滇水金鳳CHI基因的克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增（圖2），獲得IuCHI1基因全長cDNA序列741 bp，IuCHI2基因全長cDNA序列636 bp（圖3）。

圖2 CHI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR product of CHI genes

圖3 IuCHI基因全長cDNA序列Fig.3 The full-length cDNA sequence of IuCHI genes

2.2 滇水金鳳CHI基因的序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過protein BLAST 進(jìn)行序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)滇水金鳳CHI基因氨基酸序列與茶（ASU87415.1）、橄欖（AEO36936.1）、甜櫻桃（XP_021801593.1）、扁桃（VVA18533.1）等12 個物種CHI基因的氨基酸序列同源性較高，其平均同源性達(dá)到55.99%（圖4）。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)滇水金鳳CHI1和CHI2共同存在于一個大的分枝下，兩個基因均是單獨(dú)一個分枝，與滇水金鳳CHI1親緣關(guān)系最近的是橄欖，而與滇水金鳳CHI2親緣關(guān)系最近的是金花茶，推測二者為旁系親緣關(guān)系（圖5）。

圖4 滇水金鳳CHI基因氨基酸序列同源性對比Fig.4 Homologous amino acid sequence alignment of CHI genes of Impatiens uliginosa

圖5 基于IuCHI基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ 法）Fig.5 Phylogenetic tree based on IuCHI gene amino acid sequences

2.3 滇水金鳳CHI基因的表達(dá)分析

CHI基因在滇水金鳳白色花和紅色花的4 個花發(fā)育時期的表達(dá)情況如圖6 所示。IuCHI1和IuCHI2的表達(dá)表現(xiàn)出一致性，均在紅色花中呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，而在白色花中呈現(xiàn)出降低-升高-降低的趨勢，且在紅色花的謝花期和白色花的盛花期表達(dá)最高，分別為花苞開放期的22倍和18倍。

圖6 滇水金鳳CHI基因在白色和紅色滇水金鳳4個時期的相對表達(dá)Fig.6 The relative expression level of CHI genes in four stages of white and red I.uliginosa

3 結(jié)論與討論

本研究克隆得到2個滇水金鳳CHI基因，其cDNA 全長分別為741 bp和636 bp。IuCHI1和IuCHI2的氨基酸序列與茶、橄欖、甜櫻桃、扁桃等12 個物種CHI基因的氨基酸序列的平均同源性達(dá)到55.99%，有報道表明CHI基因在結(jié)構(gòu)上存在較大變化，其cDNA 序列的同源性一般為42%～65%[26]，不同的CHI基因即使在同一物種內(nèi)也會存在較大差異[7]。IuCHI1和IuCHI2在系統(tǒng)進(jìn)化樹中均為單獨(dú)的一個分枝，且二者處于同一個大分枝之下，推測二者為旁系親緣關(guān)系。CHI基因在有色花紅色滇水金鳳花瓣的4個發(fā)育時期表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢，推測可能與紅色花色苷的積累有關(guān)；而在無色花白色滇水金鳳中，CHI基因在盛花期的表達(dá)量遠(yuǎn)大于其他3個時期，推測可能與黃酮類物質(zhì)的積累有關(guān)。

CHI基因是花青素合成過程中處于上游的第2 個基因，會對下游基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響，進(jìn)而影響到花色素苷的積累和植物的顏色。研究表明，將甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）CHI基因的RNAi 載體導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜黑籽品種雙10 號中，其花蕾期的花瓣顏色減弱[27]。將水母雪蓮（Saussurea medusa）CHI基因的正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入矮牽牛中，其花色由深紅色變?yōu)闇\粉紅色，并帶有網(wǎng)狀紋路和白色斑塊，柱頭也由深綠色變?yōu)闇\綠色[28]；在新疆雪蓮（Saussurea involucrata）中轉(zhuǎn)水母雪蓮CHI基因會使其發(fā)根中總黃酮含量提高了4倍[29]；而轉(zhuǎn)入水母雪蓮CHI基因的煙草總黃酮含量提高了5倍[30]。本研究對滇水金鳳CHI基因在不同花色、不同花發(fā)育時期的表達(dá)模式進(jìn)行了探究和分析，為后續(xù)進(jìn)行CHI基因的功能驗證奠定了基礎(chǔ)，以進(jìn)一步探究CHI基因在滇水金鳳呈色過程中的調(diào)控機(jī)制，為研究滇水金鳳花器官的呈色及變異機(jī)理和鳳仙花花色改良和分子育種提供了一定的理論依據(jù)。

致謝：云南省高校園林植物與觀賞園藝科技創(chuàng)新團(tuán)隊對研究給予了幫助，謹(jǐn)致謝意！