FTO基因rs9939609單核苷酸多態(tài)性與妊娠期糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

肖玲 舒俊俊 龔丹

[摘要] 目的 探討FTO基因rs9939609單核苷酸多態(tài)性與妊娠期糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。 方法 選取2018年3～9月期間我院收治的30例妊娠期糖尿?。℅estational diabetes mellitus，GDM）患者（GDM組，n=30）及30例健康孕婦（對(duì)照組，n=30）為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法測(cè)定兩組孕婦FTO基因多態(tài)性rs9939609位點(diǎn)基因型，計(jì)算等位基因頻率并進(jìn)行比較。 結(jié)果 GDM組孕婦TT基因型頻率低于對(duì)照組，TA、AA基因型頻率高于對(duì)照組（P<0.05）。GDM組孕婦T等位基因頻率低于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 FTO基因rs9939609單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)A等位基因與妊娠期糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] FTO基因;單核苷酸多態(tài)性;妊娠期糖尿病;疾病易感性

[Abstract] Objective To explore the correlation between single nucleotide polymorphism （SNP） of FTO gene rs9939609 and the risk of gestational diabetes mellitus（GDM）. Methods 30 patients with gestational diabetes mellitus（GDM）（GDM group， n=30） and 30 healthy pregnant women（control group， n=30） admitted to our hospital from March to September 2018 were selected as research subjects. Polymerase chain reaction（PCR） method was used to determine the FTO gene polymorphism rs9939609 genotype in the two groups of pregnant women， and allele frequencies were calculated and compared. Results TT genotype frequency of pregnant women in the GDM group was lower than that of the control group， and TA genotype frequency and AA genotype frequency were higher than those of the control group（P<0.05）. The frequency of T allele of pregnant women in the GDM group was lower than that in the control group， and the frequency of A allele was higher than that in the control group（P<0.05）. Conclusion The allele A of FTO gene rs9939609 single nucleotide polymorphism is related to the increased risk of gestational diabetes mellitus.

[Key words] FTO gene; Single nucleotide polymorphism（SNP）; Gestational diabetes mellitus（GDM）; Susceptibility to diseases

妊娠糖尿?。℅estational diabetes mellitus，GDM）定義為“妊娠中期或中期診斷的糖尿病，并不明顯是顯性糖尿病”。GDM大約影響所有妊娠的7%（2%～18%），可能導(dǎo)致母親和胎兒/嬰兒的短期和長期并發(fā)癥，并且GDM被認(rèn)為是糖尿病和心血管疾病潛在風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。盡管該病的病因尚未完全闡明，但妊娠前超重狀況、妊娠期體重增加、糖尿病的種族和家族史在GDM的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用。分子技術(shù)的最新進(jìn)展強(qiáng)調(diào)了遺傳因素在糖尿病妊娠的發(fā)展、治療和并發(fā)癥中的重要作用。近年來，已有研究證明胰島素代謝途徑中幾個(gè)基因的多態(tài)性與GDM風(fēng)險(xiǎn)的增加之間存在顯著相關(guān)性[2，3]。為了建立一個(gè)預(yù)防、早期診斷和治療GDM的策略，能夠解釋GDM易感性差異的額外遺傳標(biāo)記的識(shí)別將是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。脂肪量和肥胖相關(guān)基因（Fat-mass and obesity-associated gene，F(xiàn)TO）位于16q12.2，大量研究證實(shí)，F(xiàn)TO基因 rs9939609單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)變異與肥胖和2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)[4，5]，但其與GDM的相關(guān)性在國內(nèi)尚未見報(bào)道。為此，本研究的目的是通過研究GDM患者FTO基因 rs9939609單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型，以便評(píng)估其與GDM的易感性之間的相關(guān)性，為GDM的早期診斷與防治積累數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3～9月期間我院收治的30例GDM患者（GDM組，n=30）及30例健康孕婦（對(duì)照組，n=30）為研究對(duì)象。GDM患者按照2 h血糖分為輕度GDM組[（8.1～9.0） mmol/L，n=10]、中度GDM組[（9.1～10.0） mmol/L，n=10]和重度GDM組[（10.1～11.0） mmol/L，n=10]。入組標(biāo)準(zhǔn)：①GDM組孕婦符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)者;②年齡≥22歲，孕周37～40周者;③對(duì)照組孕婦無糖尿病家族史者;④臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠合并癥或并發(fā)癥者;②合并心腦血管疾病者;③孕前糖尿病史者;④合并惡性腫瘤者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書。GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥5.1 mmol/L，1 h≥10.0 mmol/L，2 h≥8.5 mmol/L;任意一點(diǎn)血糖值異常即可診斷為妊娠期糖尿病。GDM組與對(duì)照組孕婦年齡、孕周、BMI指數(shù)等基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

1.2 方法

1.2.1 血樣的采集及DNA提取? 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，取受試者外周靜脈血各3 mL，加入EDTA抗凝管內(nèi)，充分搖勻后保存于-20℃條件待測(cè);采用QIAamp全血基因組DNA快速提取試劑盒（Qiagen公司，美國）進(jìn)行基因組DNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，將提取的基因組DNA保存于-80℃條件，統(tǒng)一測(cè)序。①取200 mg組織，放到1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol剪碎，震蕩30 s;②加0.2 mL氯仿，劇烈搖動(dòng)30 s，室溫3 min;③12 000×g，4℃離心，15 min;④吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5 mL），加等體積異丙醇，-20℃，30 min;⑤12 000×g，4℃ 離心，10 min。在管底部可見微量RNA沉淀;⑥棄上清，加75%乙醇1 mL，振蕩;⑦7500×g，4℃離心，10 min;⑧棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min;⑨沉淀溶于20 μL DEPC水，取1 μL加入79 μL DEPC水測(cè)OD260/OD280;⑩計(jì)算濃度與純度，-70℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）法測(cè)定FTO基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型? 采用PCR技術(shù)，對(duì)提取的FTO基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，10 mL PCR反應(yīng)體系：DNA模板（20 ng/μL）1 μL，2×Taqman Universal Master Mix 3 μL，20×Taqman-MGB探針0.5 μL，去離子水3.5 μL，引物序列F：5-CTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTG-3，R：5-CCCACTCCA-TTTCTG ACTGTTACC-3。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)（92℃ 15 s，60℃ 1 min），60℃ 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，采用熒光定量PCR儀（ABI7500型）讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，基因分型結(jié)果采用分析軟件進(jìn)行分析。

反應(yīng)程序：將RAPD反應(yīng)試劑加入EP管中，輕混后用100 μL石蠟油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，防止樣品在反復(fù)加熱-冷卻的過程中蒸發(fā)，蓋好蓋子，打開PCR反應(yīng)儀輸入以下反應(yīng)數(shù)據(jù)：94℃預(yù)變性5 min→94℃變性40 s→40℃退火40 s→72℃延伸1 min，將EP管放入儀器開始擴(kuò)增，循環(huán)35次;72℃延伸10 min，儀器為Model MyGene 25 Plus。見表2。

1.3 觀察指標(biāo)

比較GDM組與對(duì)照組受試者FTO基因rs9939609單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型、等位基因頻率。（1）基因組DNA抽提的血液標(biāo)本采用TIANGEN血液基因組DNA抽提系統(tǒng)（非離心柱型）抽提。（2）多態(tài)位點(diǎn)的選擇：本研究采用綜合性的多態(tài)位點(diǎn)選擇策略，即先選擇Tag SNP，再綜合現(xiàn)有的GwAs研究的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充納入其他重要多態(tài)位點(diǎn)。（3）基因多態(tài)檢測(cè)分型：在Ⅰ階段，對(duì)FTO基因的24個(gè)SNPs的分型采用SNPScall技術(shù)，由上海天昊生物技術(shù)有限公司完成。Ⅱ階段對(duì)rs9939609多態(tài)位點(diǎn)的分型實(shí)驗(yàn)是由上海輝瑞生物科技有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDM組與對(duì)照組孕婦FTO基因rs9939609位點(diǎn)基因型頻率比較

對(duì)照組中FTO基因rs9939609位點(diǎn)為TT、TA、AA基因型的孕婦分別為25例、5例、0例，GDM組中分別為20例、7例、3例，GDM組孕婦TT基因型頻率低于對(duì)照組，TA、AA基因型頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.2 GDM組與對(duì)照組孕婦FTO基因rs9939609位點(diǎn)等位基因頻率比較

GDM組孕婦T等位基因頻率低于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3討論

GDM是妊娠期最常見的疾病之一，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)，妊娠期高血糖的全球患病率為16.9%，包括妊娠期總糖尿?。ㄒ阎鸵郧拔创_診的糖尿?。┖腿焉锲谔悄虿?，GDM與母親和后代的重大短期和長期不良后果有關(guān)[6]。越來越多的證據(jù)表明，宮內(nèi)環(huán)境影響關(guān)鍵的發(fā)育過程和長期疾病發(fā)展。50多年前，國外學(xué)者Pedersen Y提出了一個(gè)著名的理論，即母體高血糖會(huì)誘發(fā)胎兒高胰島素血癥，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局;1980年， Freinkel N通過描述“燃料介導(dǎo)的致畸”擴(kuò)展了Pedersen的假說，認(rèn)為過量攝入營養(yǎng)素會(huì)導(dǎo)致胎兒高胰島素血癥，并使胎兒一生易患高胰島素血癥，導(dǎo)致肥胖和糖尿病的發(fā)展[7-9]。由于在妊娠期暴露于母親糖尿病中的許多女性后代在生育年齡時(shí)會(huì)患上肥胖癥和糖尿病，因此子宮內(nèi)營養(yǎng)過剩的后果可能被視為一個(gè)世代延續(xù)的惡性循環(huán)。為了母親和后代的健康，應(yīng)及早發(fā)現(xiàn)GDM并采取相應(yīng)預(yù)防措施，故而確定GDM發(fā)展的危險(xiǎn)因素變得越來越重要。研究證實(shí)，遺傳變異與糖尿病前期和2型糖尿病患者的GDM和進(jìn)展相關(guān)[10]。正如一系列研究所證實(shí)，2型糖尿病是由于遺傳傾向與生活方式之間的相互作用而發(fā)展起來的，GDM和2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制有許多相似之處，故而推斷基因-環(huán)境相互作用可以解釋GDM的發(fā)生與發(fā)展[11，12]。

人類FTO基因位于染色體16q12.2，幾乎在所有組織中均廣泛表達(dá)。FTO基因編碼的蛋白質(zhì)屬于2-氧戊二酸依賴性核酸脫甲基酶，涉及能量代謝[13]。遺傳背景對(duì)于理解調(diào)節(jié)肥胖的代謝途徑很重要。端粒長度磨損可能受肥胖相關(guān)炎癥和氧化應(yīng)激的影響。有新的證據(jù)表明端粒長度和肥胖是雙向相關(guān)的。FTO基因可能是一個(gè)調(diào)節(jié)“主開關(guān)”基因的例子，該基因影響對(duì)肥胖調(diào)節(jié)中許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑的表觀遺傳控制。有人認(rèn)為，肥胖相關(guān)的FTO單核苷酸多態(tài)性可能通過增加食物攝入量、增加饑餓/降低飽腹感以及調(diào)節(jié)肥胖因素來影響肥胖;另有研究指出，F(xiàn)TO 基因與生長激素釋放肽循環(huán)和瘦素水平顯著相關(guān)，是攝食行為的關(guān)鍵介質(zhì)，并與血清脂聯(lián)素、抗高血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎脂肪因子顯著相關(guān);此外，由于代謝平衡和肥胖體內(nèi)平衡的基因聯(lián)系對(duì)于慢性疾病和端粒長度的調(diào)節(jié)很重要，且端粒較短與體重指數(shù)增加、肥胖增加、腰臀比增加和內(nèi)臟脂肪堆積之間存在聯(lián)系，故而認(rèn)為FTO基因與代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[14，15]。FTO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609是研究中最常見的人群肥胖基因，風(fēng)險(xiǎn)等位基因（A等位基因）與兒童和成人的總能量（食物攝入量）增加、蛋白質(zhì)和脂肪攝入量增加有關(guān)。FTO單核苷酸多態(tài)性主要位于內(nèi)含子1中，據(jù)報(bào)道與食欲分級(jí)的個(gè)體差異、飲食失控以及在沒有饑餓的情況下進(jìn)食有關(guān)。據(jù)觀察，F(xiàn)TO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)攜帶rs9939609 A等位基因（AA或AT基因型）的兒童和青少年可自行選擇試驗(yàn)餐中能量密度更高的成分;在成人中，A等位基因攜帶者更有可能表現(xiàn)出對(duì)飲食的失控、餐后飽腹感水平的改變、饑餓感的增加和飽腹感自我評(píng)定的降低。FTO基因單核苷酸多態(tài)性rs9939609 位點(diǎn)AA基因型與神經(jīng)底物活性相關(guān)，與食物線索反應(yīng)性相關(guān)[16，17]。

國外研究人員提出，F(xiàn)TO基因可能通過影響全身炎癥反應(yīng)，參與胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展。一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）證實(shí)，位于FTO基因第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609變異體通過對(duì)體重指數(shù)的影響使歐洲人群易患糖尿病，而來自南亞人群的其他報(bào)告顯示FTO基因變異體獨(dú)立于體重指數(shù)增加了2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。從那時(shí)起，幾項(xiàng)研究代表了不同種族的人群，證實(shí)了FTO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609與2型糖尿病之間的密切聯(lián)系：2016年的一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)TO變異體對(duì)肥胖易感性的性別特異性影響，表明FTO變異體對(duì)日本男性（而非女性）2型糖尿病易感性的影響是通過FTO對(duì)體重指數(shù)的影響來介導(dǎo)的;2018年，對(duì)伊朗肥胖婦女進(jìn)行的一項(xiàng)病例對(duì)照研究表明，包括rs9939 609在內(nèi)的幾個(gè)FTO變異體也與2型糖尿病和肥胖有關(guān);最近的空間分析和薈萃分析表明FTO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609和2型糖尿病之間存在區(qū)域相關(guān)性，但報(bào)告的結(jié)果在不同種族人群中不一致[18-20]。

既然GDM與2型糖尿病之間具有相似之處，而FTO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，故而提出假設(shè)其同樣與GDM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究以GDM患者及健康孕婦為研究對(duì)象，通過測(cè)定FTO基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9939609基因型發(fā)現(xiàn)，GDM組孕婦TT基因型頻率低于對(duì)照組，TA、AA基因型頻率高于對(duì)照組，且GDM組孕婦T等位基因頻率低于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組，提示攜帶A等位基因的孕婦具有更高的GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，F(xiàn)TO基因rs9939609單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)A等位基因與妊娠期糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。早篩查、早診斷和嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)控制飲食對(duì)GDM 病例十分重要。目前臨床醫(yī)生認(rèn)為，若血糖控制滿意可等待足月自然臨產(chǎn)。如果早診斷、早治療，孕婦血糖控制滿意，對(duì)沒有合并癥或并發(fā)癥的孕婦加強(qiáng)母兒監(jiān)護(hù)，則完全可待其自然臨產(chǎn)，可以極大改善GDM產(chǎn)婦的生育結(jié)局。

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（收稿日期：2019-11-27）