黃芪和水蛭有效成分對(duì)腎小球系膜增生的作用及其機(jī)制

李宗國(guó)，時(shí)召平，張鵬飛

（承德市中醫(yī)院藥學(xué)部，河北承德 067000）

腎小球系膜增生是系膜增生性腎小球腎炎的主要病理表現(xiàn)，系膜細(xì)胞外基質(zhì)增多是引起腎小球病變的主要病理機(jī)制[1]。有研究顯示，細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶家族是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，具有分解基質(zhì)中明膠及膠原的作用[2]?；|(zhì)蛋白酶家族中的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種IV型膠原酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）中的變性I型膠原及IV型膠原為主的基膜[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)異?？商崾鹃g質(zhì)性腎炎、腎細(xì)胞癌等多種腎病[4]。目前，西醫(yī)治療系膜增生性腎小球腎炎主要采用激素類(lèi)藥物，但因患者個(gè)體差異，臨床應(yīng)用時(shí)具有較明顯副反應(yīng)。我國(guó)中醫(yī)根據(jù)系膜增生性腎小球腎炎臨床癥狀，將其歸為血尿、腎性水腫類(lèi)疾病，此類(lèi)疾病因機(jī)體氣血不通，氣機(jī)失常，水、氣、血運(yùn)輸受阻，形成水腫、淤血，血瘀累積至腎，引起腎間質(zhì)纖維化等病變。中醫(yī)認(rèn)為黃芪具有健脾益氣、活血化瘀、保腎養(yǎng)血功效，在治療腎病時(shí)有明顯療效[5]。黃芪主要有效成分包括黃芪多糖、黃芪甲苷、氨基酸、黃酮，其中的多糖成分可作為免疫促進(jìn)劑，具有抗腫瘤、抗病毒作用，黃芪甲苷在一定濃度內(nèi)可阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，水蛭入藥后具有破血逐淤、消痰飲功效，其唾液中有效成分的水蛭素具有較強(qiáng)抑制血栓作用[6]。本研究通過(guò)對(duì)小鼠腎小球系膜細(xì)胞（mouse glomerular mesangial cells，MgCs）應(yīng)用中藥黃芪、水蛭中不同有效成分進(jìn)行培養(yǎng)，觀察兩者對(duì)系膜細(xì)胞增殖及MMP-9、NF-κB水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

昆明種小鼠，體重18～22g，雌性，合格證號(hào)：01-3001，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)。小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃芪多糖組、黃芪甲苷組、水蛭素組，每組5只。

1.2 試劑來(lái)源

脂多糖（北京索來(lái)寶，貨號(hào)：L8880-10mg）；黃芪多糖（恒瑞康生物科技公司）；水蛭素凍干粉（西安百川生物科技有限公司，貨號(hào)：XABC-524）；黃芪甲苷溶液（Aladdin公司）；Cell Counting Kit-8試劑盒（北京百奧萊博，貨號(hào)：YT127）。

1.3 含藥血清小鼠模型的制備

小鼠給藥劑量參照相關(guān)文獻(xiàn)提供的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人臨床用藥劑量換算公式。各干預(yù)組分別給以黃芪多糖、黃芪甲苷、水蛭素4ml/200g/d灌胃，其他組予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)5d。于末次給藥2h后，取10%水合氯醛腹腔麻醉，在無(wú)菌條件下，自頸動(dòng)脈取血，離心滅菌后，于-70℃低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4.1 小鼠MgCs的原代培養(yǎng)及鑒定 選取18～22g 健康雌性昆明種小鼠，在無(wú)菌條件下取小鼠腎小球毛細(xì)血管間的系膜，剝離除去外周結(jié)締組織，刮除內(nèi)膜，將中膜層組織用預(yù)冷的 PBS 沖洗后剪成小塊，接種于培養(yǎng)瓶。細(xì)胞置于 10% LPS 的 DMEM 低糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將接近融合的原代培養(yǎng)細(xì)胞消化，按 1∶2 傳代。取 4～6 代MgCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 篩選LPS促進(jìn)MgCs增殖的最適條件 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MgCs細(xì)胞數(shù)為6×104/cm2接種至96孔板，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)24h，吸去培養(yǎng)基，加入不同濃度LPS（0%、5%、10%、20%、30%、40%）誘導(dǎo)MgCs增殖，分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用CCK8法檢測(cè)MgCs增殖情況，鏡下觀察到系膜細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且呈梭型，表示MgCs增生成功，確定LPS添加濃度為30%。

1.5 預(yù)先制備試劑

將10mg脂多糖溶于5ml生理鹽水中，制成脂多糖溶液。將0.5g黃芪多糖溶于10ml生理鹽水中，制成黃芪多糖溶液。將100ATU水蛭素凍干粉溶于2ml生理鹽水，制成水蛭素溶液。黃芪甲苷溶液購(gòu)自Aladdin公司。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒培養(yǎng)細(xì)胞12h后，向黃芪多糖組、黃芪甲苷組、水蛭素組中分別加入500μg/ml黃芪多糖溶液、40μg/ml黃芪甲苷溶液、10μg/ml水蛭素溶液。繼續(xù)于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后收集細(xì)胞。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將待測(cè)細(xì)胞制成1×106個(gè)/m l的懸液，分別用Annexin V-fluorescein isothiocyanate（FITC）、碘化丙啶（propidiumiodide，PI）避光染色15min。使用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

使用TRIzol試劑從細(xì)胞組織中分離總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總共2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，引物序列如下。MMP-9：正向5’- ATCCCTCAACATCGCAACTGT-3’，反向5’-CAGC-CTCTGGTAGATTATCAAGC-3’；NF-κB：正向5’-CCAGATCAATGGCTACAC GG-3’，反向5’-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3’；β-Actin：正向5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，反向5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。使用 SYBR Green PCR Master Mix 在 7500 Fast Real-Time PCR System中，以10μl的終體積進(jìn)行定量PCR。PCR在以下條件下進(jìn)行：50℃2min，隨后94℃Taq酶活化30s，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示基因表達(dá)水平。

1.9 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)基因表達(dá)

各組細(xì)胞藥物作用48h后，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton-100通透細(xì)胞，3% H2O2去除過(guò)氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉，一抗 4℃濕盒孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照組加PBS代替一抗，生物素化二抗孵育，鏈霉菌抗生素-過(guò)氧化物酶溶液孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。采用免疫細(xì)胞化學(xué)分析法測(cè)定MMP-9、NF-κB蛋白表達(dá)水平。采用免疫細(xì)胞化學(xué)分析法測(cè)定MMP-9、NF-κB蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖1和圖2所示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較單因素方差分析，方差不齊的計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以（）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細(xì)胞凋亡率增高

經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)增生后，加入黃芪多糖培養(yǎng)的黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細(xì)胞凋亡率均高于模型組與正常組（P＜0.05），見(jiàn)表1：

表1 各組小鼠凋亡率比較Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

表1 各組小鼠凋亡率比較Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

組別 凋亡率正常組模型組 7.85±0.36% 13.56±0.79%黃芪多糖組 28.74±1.23%黃芪甲苷組 25.31±1.38%水蛭素組 36.25±1.65%F 480.810 P＜0.001

2.2 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)降低

MMP-9定位于細(xì)胞質(zhì)，各干預(yù)組MMP-9蛋白表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0.05），但高于正常組（P＜0.05）；各干預(yù)組之間兩兩比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表2：

表2 各組小鼠MMP-9免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

表2 各組小鼠MMP-9免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 MMP-9（%）正常組 1.53±0.42模型組 65.31±8.84a黃芪多糖組 48.64±3.62ab黃芪甲苷組 47.31±3.28ab水蛭素組 38.47±3.25ab F 143.050 P＜0.001

2.3 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)降低

NF-κB定位于細(xì)胞質(zhì)，各干預(yù)組系膜增生較少，NF-κB蛋白表達(dá)均顯著低于模型組，但高于正常組（P＜0.05）；各干預(yù)組之間兩兩比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表3：

表3 各組小鼠NF-κB免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

表3 各組小鼠NF-κB免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB（%）正常組 1.95±0.34模型組 29.18±8.56a黃芪多糖組 17.42±2.15ab黃芪甲苷組 16.78±2.36ab水蛭素組 11.18±1.83ab F 32.100 P＜0.001

2.4 各組小鼠MMP-9 mRNA的PCR檢測(cè)結(jié)果比較

各干預(yù)組MMP-9 mRNA明顯低于正常組及模型組（P＜0.05）；組內(nèi)兩兩比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表4：

表4 各組小鼠MMP-9 mRNA PCR檢測(cè)結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

表4 各組小鼠MMP-9 mRNA PCR檢測(cè)結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 MMP-9正常組 1.00±0.00模型組 8.42±0.91a黃芪多糖組 0.23±0.05ab黃芪甲苷組 0.25±0.03ab水蛭素組 0.14±0.02ab F 385.100 P＜0.001

2.5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測(cè)結(jié)果比較

各干預(yù)組MMP-9 mRNA明顯低于正常組及模型組（P＜0.05）；組內(nèi)兩兩比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表5：

表5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測(cè)結(jié)果比較Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

表5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測(cè)結(jié)果比較Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB正常組 1.00±0.00模型組 2.42±0.19a黃芪多糖組 0.51±0.03ab黃芪甲苷組 0.52±0.04ab水蛭素組 0.34±0.01ab F 479.190 P＜0.001

3 討論

系膜增生性腎小球腎炎以彌漫性腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜細(xì)胞外基質(zhì)增多為典型特征[8]。胃腸、呼吸道黏膜感染導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能降低，是系膜增生性腎小球腎炎的重要病因。患者發(fā)病后會(huì)逐漸出現(xiàn)腎功能受損、腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等病理改變。因機(jī)體免疫功能降低，大量炎癥因子釋放，會(huì)加速腎小球損傷進(jìn)程。同時(shí)，炎癥因子的釋放還可促進(jìn)NF-κB活化，被激活后的NF-κB亦可誘導(dǎo)炎癥因子釋放，兩者相互促進(jìn)，使腎臟進(jìn)一步受損[9]。因此推測(cè)，通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)水平，可調(diào)控系膜增生性腎小球腎炎發(fā)展進(jìn)程。細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多是系膜細(xì)胞增生的基礎(chǔ)病理變化，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解過(guò)程受MMP家族及其組織抑制因子調(diào)節(jié)[10]。MMP家族中的MMP-9除具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用外，還可分解腎小球基底膜。腎小球基底膜是維持腎臟完整性的重要結(jié)構(gòu)，在腎小球?yàn)V過(guò)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。因此，MMP-9表達(dá)異?？蓪?dǎo)致腎小球功能及腎臟結(jié)構(gòu)功能受損。

近年來(lái)，對(duì)中醫(yī)方法治療腎病的臨床療效觀察已成為研究熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，黃芪、丹參能降低腎小球腎炎患者尿白蛋白、血脂及血漿白蛋白水平[12]。我國(guó)中醫(yī)認(rèn)為，黃芪性溫，歸脾肺經(jīng)，在治療慢性腎炎、腎病綜合征等腎病時(shí)有較好療效。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)黃芪的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪可通過(guò)保護(hù)紅細(xì)胞，抑制血小板形成血栓，來(lái)改善腎病患者血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)[13]。另有研究表示，黃芪可通過(guò)抑制腎臟生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子表達(dá)，達(dá)到抑制系膜細(xì)胞增生的目的[14]。此外，水蛭作為一味常用于破血、祛瘀、通經(jīng)的傳統(tǒng)中藥，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)其含有水蛭素、多臺(tái)、肝素、抗血栓素等多種物質(zhì)[15]。其中，水蛭素是水蛭唾液中的一種抗凝血物質(zhì)，也是一種天然特效凝血酶抑制劑，有強(qiáng)抗血栓作用。同時(shí)，水蛭素還能抗炎癥因子，清除免疫反應(yīng)產(chǎn)物，調(diào)節(jié)免疫功能。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)增生建立系膜增生性腎小球腎炎模型后，給予不同黃芪及水蛭有效成分繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細(xì)胞凋亡率均高于模型組與正常組，說(shuō)明黃芪多糖、黃芪甲苷及水蛭素均具有促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡的作用。而且，干預(yù)組中MMP-9和NF-κB的表達(dá)均較模型組顯著降低，表明黃芪多糖、黃芪甲苷及水蛭素均可顯著抑制系膜細(xì)胞的增生。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)水平，降低炎癥細(xì)胞因子釋放量，從而減輕炎癥反應(yīng)，阻止腎小球硬化或腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程。黃芪及水蛭中各有效成分通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)，避免腎臟基底膜被大量降解，以保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)功能。但給予黃芪、水蛭不同有效成分抑制系膜增生后的MMP-9仍高于正常水平，此時(shí)升高的MMP-9可降解增多的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步抑制系膜增生。

綜上所述，黃芪與水蛭作為中醫(yī)中具有活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)腎功效的重要藥物，在治療系膜增生性腎小球腎炎時(shí)具有較好效果，可于臨床使用。但本研究?jī)H檢測(cè)了NFκB、MMP-9蛋白表達(dá)水平，未深入分析其基因與系膜細(xì)胞增生關(guān)系，筆者將在后續(xù)研究中繼續(xù)探索其對(duì)系膜增生的影響機(jī)制。