紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變高產(chǎn)纖維素酶菌株

左 勇，何頌捷，秦世蓉，楊建飛，徐 佳，黃雪芹，陳 靜，宋 華

（1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓644000；2.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓644000；3.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都610101；4.四川施利旺農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，四川 宜賓644000）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)[1]，化肥年使用量占世界近40%，居世界第一位，超過(guò)了美國(guó)、印度的總和[2]。由于過(guò)量使用化肥，極大危及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康[3]，因此傳統(tǒng)的化肥已不能適應(yīng)農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品可持續(xù)發(fā)展，發(fā)展高效環(huán)保的生物有機(jī)肥勢(shì)在必行[4]。

生物有機(jī)肥是特定功能微生物與動(dòng)植物殘?bào)w、農(nóng)作物秸稈等為來(lái)源并經(jīng)無(wú)害化處理、腐熟的有機(jī)物料復(fù)合而成的一類(lèi)兼具微生物肥料和有機(jī)肥效應(yīng)的肥料[5]。生物有機(jī)肥和飼料的原料主要來(lái)源于秸稈、豆粕、棉粕、菜籽餅、酒糟、醋糟、木薯渣、糖渣、糠醛渣、鋸末、餐廚垃圾、菜市場(chǎng)尾菜等，由于纖維素不易被降解利用，因此現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)施用生物有機(jī)肥的積極性不高，使用率相對(duì)較低[6-7]。

在生物有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中，加入高酶活的菌種，能縮短有機(jī)肥的發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量[8]。目前，自然分離的菌種產(chǎn)纖維素酶能力較低[9]，其酶活很難滿(mǎn)足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的需求[10]。誘變育種就是利用誘變劑加以處理，提高誘變對(duì)象的突變頻率，最后通過(guò)相應(yīng)的篩選方式來(lái)提高菌種能力，誘變育種主要分為物理誘變和化學(xué)誘變。其中物理誘變中以紫外線輻射的使用最為普遍，其他誘變因子則受到現(xiàn)階段設(shè)備條件的限制，還未能大量普及。紫外線作為物理誘變用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，近幾年紫外誘變依舊作為首選[11]，化學(xué)誘變劑常用于處理遲變突變，對(duì)某特定的基因或核酸有選擇性作用[12-13]。因此本研究從基因突變的角度出發(fā)，利用紫外和亞硝酸鈉（NaNO2）設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)獲得復(fù)合誘變的最佳條件，選育得到遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)纖維素酶突變株，為高產(chǎn)纖維素酶菌種在綠色、環(huán)保農(nóng)業(yè)中的開(kāi)發(fā)尊定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）：本實(shí)驗(yàn)室從酒醅中篩選得到。

1.1.2 化學(xué)試劑

羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖（生化試劑）、磷酸二氫胺、硫酸鎂（均為分析純）：重慶川東化工集團(tuán)有限公司；纖維素粉（生化試劑）、纖維素酶（10 000 U/mL）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[14-15]

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20min。

PDA固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉。

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMCNa）培養(yǎng)基：KH2PO41g，（NH4）2SO41g，MgSO4·7H2O 0.15 g，CMC-Na 15 g，酵母粉1 g，瓊脂20 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

剛果紅培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO42 g/L、瓊脂18 g、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、纖維素粉1.88 g/L、剛果紅0.2 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，（NH4）2SO44 g，NaCl 1.25 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，瓊脂粉20 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

STARTER2C pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；T6紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YXQLS-75S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ME104E/02電子天平：托利多儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喬欣科學(xué)儀器有限公司；GZ-250-HS11恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；THZ-98A 恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃條件下靜置恒溫培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 菌懸液的制備

將活化的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線和酶活力曲線的繪制

將菌液接種至50 mL/250 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用光電比濁法測(cè)定原始菌株的生長(zhǎng)曲線[9]；菌株在28 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即為粗酶液，每4 h在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定吸光度值（OD600nm值），并用DNS法測(cè)定CMC酶活[16]，繪制貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）生長(zhǎng)曲線和酶活力曲線。

纖維素酶活的測(cè)定[17]：取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL 1%CMC緩沖液，50 ℃水浴30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷卻后定容至10 mL。對(duì)照組加0.5 mL滅活的粗酶液代替粗酶液，其他條件不變，于540 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定OD540nm值。

纖維素酶活定義[18]：將每分鐘由羧甲基纖維素鈉水解成1.0 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 復(fù)合誘變

（1）紫外誘變

用無(wú)菌水將培養(yǎng)好的菌液梯度稀釋?zhuān)?0-6梯度5 mL菌懸液于培養(yǎng)皿中；在暗室中先將紫外預(yù)熱20 min，再將培養(yǎng)皿置于紫外燈20 cm處分別照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s后4 ℃冷藏2 h。避光條件下取60 μL菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，避光、28 ℃條件下靜置培養(yǎng)2～3 d，計(jì)算不同紫外誘變時(shí)間對(duì)原始菌株的致死率，其計(jì)算公式如下：

（2）亞硝酸鈉（NaNO2）誘變

將紫外誘變選出的菌種制成菌液進(jìn)行NaNO2誘變，將誘變后的菌液稀釋涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，與空白組對(duì)照計(jì)算致死率。

1.3.5 復(fù)合誘變條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

NaNO2誘變時(shí)間：將1mL菌液加入1mL0.2mol/LNaNO2中，再加入1 mL pH 4.4醋酸緩沖液，28 ℃水浴，反應(yīng)5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后加入2 mL pH 8.6 Na2HPO4緩沖液，考察誘變時(shí)間對(duì)纖維素酶酶活的影響。

在此基礎(chǔ)上依次考察NaNO2誘變溫度（20℃、25℃、30℃、35 ℃、40 ℃）、NaNO2濃度（0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L）對(duì)纖維素酶酶活的影響。

（2）正交試驗(yàn)

由于復(fù)合誘變是多因素相互作用對(duì)誘變效果影響較大，因此以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)影響致死率的幾個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，即以誘變溫度（A）、誘變時(shí)間（B）和NaNO2濃度（C）為試驗(yàn)影響因素，以致死率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 復(fù)合誘變條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for complex mutagenesis conditions optimization

1.3.6 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

初篩：將復(fù)合誘變后的菌株接種到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h。選取在培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)好的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：選取在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落點(diǎn)接到PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取水解圈直徑（D）/菌落直徑（d）值大的菌株測(cè)定其纖維素酶酶活。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將復(fù)合誘變后纖維素酶活最高的突變株轉(zhuǎn)接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代。用DNS法測(cè)定隔代之間的酶活變化，考察誘變后菌株的穩(wěn)定性。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一般線性模型分析，采用Origin 7.5進(jìn)行圖表的繪制。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量和酶活力曲線

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）生長(zhǎng)曲線和酶活力曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線和酶活力曲線Fig. 1 Growth curve and enzyme activity curve of Bacillus velezensis

由圖1可知，貝萊斯芽孢桿菌在經(jīng)過(guò)短暫遲緩期后，在前16 h處于對(duì)數(shù)期，菌體濃度增加速率快，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度增長(zhǎng)緩慢，24 h后菌種進(jìn)入衰亡期，生長(zhǎng)緩慢菌體濃度幾乎保持不變。菌株在培養(yǎng)24 h之前，纖維素酶活隨培養(yǎng)時(shí)間而增大；在培養(yǎng)24 h時(shí)纖維素酶活達(dá)到最高，達(dá)到49.31 U/mL；培養(yǎng)24 h后由于發(fā)酵液中底物消耗較多和產(chǎn)物的反饋抑制，酶活緩慢下降一段后達(dá)到平衡。因此，選擇培養(yǎng)24 h的菌株作為出發(fā)菌進(jìn)行紫外誘變。

2.2 紫外誘變

通過(guò)紫外對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變處理，根據(jù)不同紫外誘變時(shí)間的致死率，優(yōu)化紫外處理時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，對(duì)貝萊斯芽孢桿菌出發(fā)菌進(jìn)行紫外誘變時(shí)，隨著誘變時(shí)間的增加，菌株的致死率也隨之增加。當(dāng)紫外照射時(shí)間為150 s時(shí)，菌株的致死率達(dá)到85.4%，滿(mǎn)足菌株正突變率最高的致死率范圍（80%～90%）[20]，此時(shí)誘變效果最佳。所以選擇紫外誘變時(shí)間為150 s。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌紫外誘變致死率Fig. 2 Lethality rate of Bacillus velezensis by ultraviolet mutagenesis

2.3 復(fù)合誘變條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同NaNO2誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響

用NaNO2對(duì)菌株進(jìn)行誘變時(shí)，處理時(shí)間不同菌株基因發(fā)生突變的概率有差異，本研究在室溫條件下用濃度為0.2 mol/L的NaNO2，根據(jù)不同誘變時(shí)間對(duì)菌種的致死率，選擇最優(yōu)范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同NaNO2誘變時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響Fig. 3 Effect of different NaNO2 mutagenesis time on lethality rate of strains

由圖3可知，隨著NaNO2處理時(shí)間的增長(zhǎng)，菌種的致死率增加，說(shuō)明NaNO2處理對(duì)菌種有明顯的致死性，菌株對(duì)NaNO2較敏感。當(dāng)NaNO2誘變時(shí)間為25 min時(shí)，菌種的致死率達(dá)到90.1%。因此，選擇NaNO2最佳誘變時(shí)間為25 min。

2.3.2 不同NaNO2誘變溫度對(duì)致死率影響

對(duì)菌株進(jìn)行誘變時(shí)，溫度對(duì)誘變劑的誘變效果有一定影響，本研究通過(guò)用0.2 mol/L的NaNO2在不同溫度下誘變處理菌種25 min，根據(jù)致死率優(yōu)化NaNO2誘變溫度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在20～45 ℃范圍內(nèi)NaNO2對(duì)菌種進(jìn)行誘變時(shí)，致死率隨溫度增加而增加。當(dāng)溫度在25～35 ℃時(shí)，溫度處于細(xì)菌生長(zhǎng)的最適溫度范圍，此時(shí)菌株對(duì)NaNO2較敏感，因此致死率增加最快。當(dāng)誘變溫度為25 ℃時(shí)，菌種致死率達(dá)到85.0%。當(dāng)溫度超過(guò)40℃，菌種受到高溫和誘變劑的影響，致死率＞97%。因此，選擇NaNO2最佳誘變溫度為25 ℃。

圖4 不同NaNO2誘變溫度對(duì)菌株致死率的影響Fig. 4 Effect of different NaNO2 mutagenesis temperature on lethality rate of strains

2.3.3 不同NaNO2濃度對(duì)致死率的影響

用NaNO2對(duì)菌株進(jìn)行誘變，在25 ℃條件下用不同濃度NaNO2誘變處理25 min，根據(jù)致死率優(yōu)化NaNO2誘變濃度，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同NaNO2濃度對(duì)菌株致死率的影響Fig. 5 Effect of different NaNO2 concentration on lethality rate of strains

由圖5可知，菌種對(duì)NaNO2誘變敏感，在NaNO2濃度為0.1 mol/L時(shí)致死率達(dá)到70.8%。隨NaNO2的濃度上升，菌種致死率持續(xù)升高，當(dāng)NaNO2濃度為0.2 mol/L時(shí)，致死率達(dá)到87.8%。NaNO2濃度＞0.4 mol/L后，受高濃度NaNO2的作用菌種幾乎全部失活。因此，選擇NaNO2最佳誘變濃度為0.2 mol/L。

2.3.4 復(fù)合誘變條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇誘變溫度（A）、誘變時(shí)間（B）和NaNO2濃度（C）為試驗(yàn)影響因素，以致死率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 復(fù)合誘變條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for complex mutagenesis conditions optimization

由表2可知，由極差R得到誘變溫度、時(shí)間和NaNO2濃度對(duì)致死率影響順序?yàn)镃＞B＞A，說(shuō)明NaNO2濃度對(duì)致死率影響最大，對(duì)致死率影響最小的因素是誘變溫度，由正交試驗(yàn)結(jié)果分析得到最佳NaNO2誘變條件組合為A1B1C1，即誘變溫度23 ℃、誘變時(shí)間23 min、NaNO2濃度0.25 mol/L。在此優(yōu)化復(fù)合誘變條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，致死率達(dá)到83.8%，與正交分析結(jié)果相符合，說(shuō)明NaNO2最佳誘變條件組合為A1B1C1。

2.4 高產(chǎn)纖維素酶突變株篩選

按最優(yōu)復(fù)合誘變條件對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變后，用DNS法測(cè)定突變菌株纖維素酶活并與原始菌株酶活比較，結(jié)果見(jiàn)表3。誘變菌株在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用剛果紅溶液對(duì)長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行染色，根據(jù)水解圈大小和菌圈大小比值（D/d值）選擇比值大的菌株，突變菌株的D/d值見(jiàn)圖6。

由表3可知，經(jīng)復(fù)合誘變篩選出的菌株均有纖維素酶活，其中突變株UN-2酶活提高最少，僅提高到原始酶活的126.3%，突變株UN-5纖維素酶活提高最明顯，比原始菌株酶活提高了205.8%。

表3 突變菌株酶活與原始菌株酶活比較Table 3 Enzyme activity ratio of mutant strain and original strain

圖6 復(fù)合突變菌株D/d值和酶活測(cè)定結(jié)果Fig. 6 Determination results of D/d values and enzyme activities of complex mutagenesis strains

由圖6可知，剛果紅染色中水解圈和菌落比大的酶活也相對(duì)較高，其中菌株UN-5的纖維素酶酶活最高，達(dá)到101.48 U/mL，比原始菌株酶活提高了205.8%，說(shuō)明經(jīng)UVNaNO2復(fù)合誘變，原始菌株貝萊斯芽孢桿菌的突變菌株產(chǎn)纖維素酶能力增強(qiáng)。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

將復(fù)合誘變后篩選出的突變株UN-5接種至CMC-Na培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代10代，用DNS法測(cè)定每代的纖維素酶酶活，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，突變株UN-5連續(xù)傳代10代后纖維素酶活仍然達(dá)到100.5 U/mL。與第一代相比，纖維素酶活稍有降低，酶活降低1 U/mL，變化率為1%，變化幅度不顯著，連續(xù)傳代對(duì)突變株UN-5酶活雖然有一定影響，但變化很小，傳代10代后酶活仍有99.0%。說(shuō)明該突變株遺傳性狀穩(wěn)定，可進(jìn)一步應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

表4 突變菌株UN-5遺傳穩(wěn)定性Table 4 Genetic stability of mutant strain UN-5

3 結(jié)論

本研究以貝萊斯芽孢桿菌為出發(fā)菌，確定菌種在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)對(duì)數(shù)期，菌株原始酶活為49.31 U/mL；用紫外對(duì)菌株誘變150 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到85.4%。經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化誘變條件，得到NaNO2誘變的最佳條件：23 ℃條件下0.25 mol/L的NaNO2誘變處理23 min。按最優(yōu)誘變條件對(duì)原始菌株進(jìn)行紫外-NaNO2復(fù)合誘變處理，突變株UN-5纖維素酶產(chǎn)量最高，其酶活達(dá)到101.5 U/mL，比原始菌株的酶活提高了205.8%。突變株UN-5連續(xù)傳代10代后酶活仍有99.0%，遺傳性能穩(wěn)定，可用于生物有機(jī)肥生產(chǎn)。