紅茂草多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)小鼠免疫功能的影響

趙 強(qiáng)，李 昭，楊勸生，馬 坤，趙陽安，趙金鳳

（1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水741001；2.甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院，甘肅 天水741025）

紅茂草[Dicranostigma leptodum（Maxim.）Fedde（DLF）]在《本草綱目》中記載為禿瘡花、石長生等，且為野生，始于獸用，是陜甘地區(qū)民間習(xí)用藥材，在甘肅秦嶺南北、渭水流域分布最為廣泛[1-3]。其可用于治療羊口瘡、創(chuàng)傷性炎癥、皮膚毛囊炎、扁桃腺炎，咽喉腫痛、淋巴結(jié)核、禿疤疥癬等癥[4-7]。近年來，有學(xué)者主要針對(duì)紅茂草生物堿、揮發(fā)油、黃酮類等有效成分進(jìn)行分離提取，制成不同的藥物劑型，從免疫學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)等方面對(duì)其進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，尤其發(fā)現(xiàn)紅茂草生物堿抑菌抗炎作用十分顯著[8-10]。

多糖具有多種重要生物活性，有研究表明，紅茂草制劑有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，使T細(xì)胞增殖與活化；刺激巨噬細(xì)胞活化及細(xì)胞因子分泌；誘導(dǎo)并促使IL-2的分泌，增加紅細(xì)胞免疫功能；對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷有保護(hù)作用，對(duì)化學(xué)試劑誘發(fā)的溶血有一定的抑制作用；小鼠腹腔注射紅茂草提取物后，與模型組比較，紅細(xì)胞數(shù)目增加，血紅蛋白含量提高，白細(xì)胞數(shù)目減少，血漿丙二醛含量降低，四項(xiàng)指標(biāo)均接近正常組[11-14]。為系統(tǒng)了解紅茂草多糖的生物學(xué)功能，該研究通過正交法確定了紅茂草多糖的提取工藝，將其作用于環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠，并對(duì)其免疫功能進(jìn)行研究，為該藥材的深層次開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

紅茂草：采于甘肅省天水市甘谷縣新興鎮(zhèn)北山陽坡，經(jīng)甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所鑒定。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；小牛血清（規(guī)格100 mL）、補(bǔ)體（豚鼠血清）（純度≥99%）、巴比妥酸（純度≥98%）：上海麥克林生物試劑公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）（純度≥98%）：山西普德藥業(yè)有限公司；巴比妥鈉（純度≥99%）、酚紅（分析純）、微孔濾膜（0.22 μm）：廣州捷倍斯生物科技有限公司；Hank's液（pH=7.2～7.4）、氫氧化鈉、濃硫酸、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

40日齡BALB/c試驗(yàn)小鼠（18～20 g）100只，雌雄各半購自甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-751GD型紫外-可見光分光光度計(jì)：上海分析儀器廠；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AB104-S型電子分析天平：瑞士梅特勤公司；TD5A-WS型低速離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CR21G II型高速冷凍離心機(jī)：天美科技有限公司；CL-40S型全自動(dòng)高壓滅菌鎘：日本ALP公司；51型筆式pH酸度計(jì)：上海牧晨電子技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅茂草多糖提取工藝流程及操作要點(diǎn)

稱取紅茂草干草粉末50g，經(jīng)風(fēng)干、粉碎、過篩，用150mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液浸泡24 h后，轉(zhuǎn)入索氏提取器，70 ℃回流熱處理2 h，進(jìn)行抽濾，50 ℃真空干燥，得到預(yù)處理樣品（粗品）。再將預(yù)處理得到的紅茂草樣品加入100 mL蒸餾水，80 ℃索氏回流提取2 h，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、抽濾，濾液再經(jīng)濃縮后加入等體積無水乙醇進(jìn)行醇沉。靜置、抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚潤洗，將沉淀轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥，得紅茂草多糖。

1.3.2 多糖含量的測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取質(zhì)量濃度為0、20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL[15]、120 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL置于試管中，各加6%苯酚溶液1.8 mL，搖勻，分別再迅速滴加濃硫酸7.5 mL，搖勻后水浴20 min，冷卻至室溫。另以蒸餾水作空白試驗(yàn)。紫外分光光度計(jì)于波長483 nm處測吸光度值，以吸光度值（Y）對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度（X）繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.004 7X+0.010 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 5。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多糖含量，并計(jì)算多糖產(chǎn)率[8]，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 多醣提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)[15-17]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲波處理時(shí)間、料液比、索氏回流時(shí)間、醇沉?xí)r間、酸堿度和乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響紅茂草多糖提取效果的主要考察因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素與水平見表1。

表1 紅茂草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization of Dicranostigma leptodum polysaccharides

1.3.4 紅茂草多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響

（1）動(dòng)物免疫抑制模型

選取50只BALB/c試驗(yàn)小鼠（18～20 g），雌雄各半，一周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為5組，每組10只。第1組為生理鹽水對(duì)照組，每天灌胃無菌生理鹽水0.5 mL；第2組為環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組，每天灌胃0.9%的生理鹽水0.5 mL，連續(xù)灌胃3 d后，隔天腹腔注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺，共注射5次；第3、4、5組為紅茂草多糖試驗(yàn)組，各組分別按100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的劑量每天灌胃紅茂草多糖，連續(xù)灌胃3 d后，各試驗(yàn)組灌胃的同時(shí)隔天腹腔注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺，共注射5次[18]。

（2）胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定

按照1.3.4（1）方法構(gòu)建模型，最后一次注射環(huán)磷酰胺3 d后，將建模小鼠稱質(zhì)量、處死，摘取胸腺、脾臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，其公式如下：

（3）對(duì)免疫功能低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞和血清溶血素含量的影響

按照1.3.4（1）方法構(gòu)建的動(dòng)物模型，最后一次注射環(huán)磷酰胺3 d后，全部小鼠腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cells，SRBC）0.2 mL/只，當(dāng)小鼠經(jīng)2%的SRBC免疫3 d后，測量全部小鼠左后足趾的厚度，而后在其足趾皮下注射20%的SRBC 20 μL（約1×108SRBC），并與注射后24 h、48 h各測一次同一部位的足趾厚度，免疫5 d后將所有供試小鼠稱質(zhì)量，眼眶采血，室溫條件下放置30 min，2 500 r/min離心10 min，取血清分裝，備用；小鼠斷頸椎處死，無菌條件下取其脾臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量。參考張錦錦等[19]的方法，分別測定紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、對(duì)抗體生成細(xì)胞的影響和對(duì)血清半數(shù)溶血值（50%hemolytic value，HC50）的影響。

SRBC半數(shù)溶血值：取10%SRBC，0.25 mL，加SA液至4 mL，測定OD540nm值。

（4）巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測

按照1.3.4方法構(gòu)建模型，最后一次注射環(huán)磷酰胺48 h后，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞1 mL，2 h后頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔中注射含5%小牛血清的Hank's液2 mL，輕揉小鼠腹部1 min，在腹部剖一小口，用吸管吸取腹腔液，將各處理組小鼠腹腔液混合，涂片，將其放入墊有濕紗布的瓷盤中，置于37 ℃恒溫箱中30 min，而后用生理鹽水沖洗懸浮的細(xì)胞，室溫條件下晾干，Giemsa染色10 min，蒸餾水沖洗多余染料，晾干、計(jì)數(shù)，每片計(jì)數(shù)200個(gè)吞噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)[20-21]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲波處理時(shí)間、料液比、索氏回流時(shí)間、醇沉?xí)r間、酸堿度和醇沉濃度為影響紅茂草多糖提取效果的主要考察因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化多糖提取條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表2 紅茂草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization of Dicranostigma leptodum polysaccharides

續(xù)表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響紅茂草多糖產(chǎn)率的主次因素為B＞F＞C＞E＞A＞D，優(yōu)選出的最佳提取工藝組合為A4B3C4D4E2F3，即超聲波處理35 min、料液比為1∶20（g∶mL）、索氏回流160 min、醇沉28 h、pH為5和乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。按此工藝條件其多糖產(chǎn)率可達(dá)1.19%。由表3可知，僅C因素對(duì)結(jié)果影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.2 對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

以環(huán)磷酰胺為免疫抑制劑，100 mg/kg劑量連續(xù)對(duì)小鼠腹腔注射5次，成功構(gòu)建小鼠免疫抑制模型。由表4可知，與對(duì)照組相比，CY組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯下降，說明免疫抑制造模成功。不同濃度的紅茂草多糖灌胃配合CY腹腔注射處理組，與CY組相比，100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的紅茂草多糖可對(duì)抗CY造成的免疫抑制，對(duì)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有不同程度的提升作用，差異極顯著（P＜0.01）。給免疫功能低下小鼠灌服紅茂草多糖溶液，在100～400 mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅茂草多糖對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)呈明顯上升趨勢，能顯著提高小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.05），表明紅茂草多糖促進(jìn)了小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

表4 紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響Table 4 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on thymus index and spleen index of low immune mice

2.3 對(duì)免疫功能低下小鼠的影響

2.3.1 對(duì)免疫功能低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

小鼠足趾皮下注射10%SRBC前、注射10%SRBC 24 h和48 h后各測量一次試驗(yàn)鼠足趾厚度。由表5可知，CY組能顯著降低小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的能力，空白對(duì)照組24 h和48 h足趾厚度與CY組相比均有極顯著差異（P＜0.01），說明CY能夠降低遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的能力，造模成功。與CY組相比，紅茂草多糖三個(gè)劑量組對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)作用在24 h和48 h均極顯著提高（P＜0.01），說明紅茂草多糖能夠提高免疫低下小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。

表5 紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Table 5 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on delayed allergic reaction of low immune mice

2.3.2 對(duì)免疫功能低下小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

通過定量溶血分光光度法測定紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠抗體生成細(xì)胞的影響。由表6可知，與空白對(duì)照組相比，CY組小鼠脾淋巴細(xì)胞光密度差值極顯著降低（P＜0.01），說明CY可抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化，建模成功；紅茂草多糖處理組與CY組相比，小鼠脾淋巴細(xì)胞光密度差值極顯著升高（P＜0.01），且隨紅茂草多糖劑量的提高而增大，表明紅茂草多糖能提高免疫功能低下小鼠抗體生成細(xì)胞分泌抗體的能力，和劑量呈正相關(guān)性，反映高濃度多糖對(duì)免疫功能低下小鼠抗體生成細(xì)胞分泌抗體的促進(jìn)作用更加明顯，紅茂草多糖能一定程度上逆轉(zhuǎn)CY所致的小鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的降低，增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能。

表6 紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠抗體生成細(xì)胞的影響Table 6 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on antibody-producing cells of low immune mice

2.3.3 對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素含量的影響

血清半數(shù)溶血值（HC50）變化是評(píng)定藥物對(duì)體液免疫作用效果的一個(gè)重要指標(biāo)。由表7可知，與CY組相比，100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的紅茂草多糖均能顯著提高小鼠血清半數(shù)溶血值，100 mg/kg差異顯著（P＜0.05），200 mg/kg和400 mg/kg組差異極顯著（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，紅茂草多糖處理組均低于空白組，100 mg/kg和200 mg/kg差異極顯著（P＜0.01），400 mg/kg無顯著差異性（P＞0.05）。表明紅茂草多糖可以提高免疫功能低下小鼠血清溶血素含量，高濃度條件下可以使免疫功能低下小鼠血清溶血素接近正常水平。

表7 紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響Table 7 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on serum hemolysin of low immune mice

2.3.4 對(duì)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

由表8可知，與空白對(duì)照組相比，CY組巨噬細(xì)胞吞噬百分率極顯著降低（P＜0.01），說明免疫功能低下小鼠模型建立成功；紅茂草多糖200 mg/kg組的吞噬百分率與CY組相比顯著提高（P＜0.05），紅茂草多糖400 mg/kg組胞的吞噬百分率與CY組相比極顯著提高（P＜0.01），紅茂草多糖100 mg/kg組的吞噬百分率與CY組相比有所提高，但無顯著差異（P＞0.05）；紅茂草多糖處理組的吞噬指數(shù)與CY組相比有一定程度的提高，但無顯著差異性（P＞0.05），空白對(duì)照組吞噬指數(shù)略高于CY組，但也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明紅茂草多糖作用于免疫抑制小鼠主要是促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增值和激活巨噬細(xì)胞，但對(duì)巨噬細(xì)胞本身的吞噬效率沒多大影響，紅茂草多糖能促進(jìn)小鼠非特異性免疫功能。

表8 紅茂草多糖對(duì)免疫功能低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響Table 8 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on peritoneal macrophage of low immune mice

3 結(jié)論

通過對(duì)紅茂草多糖提取的一系列影響因素進(jìn)行考察，確定其最佳正交提取工藝為超聲波處理35 min、料液比為1∶20、索氏回流160 min、醇沉28 h、pH為5和體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，按此工藝條件其多糖產(chǎn)率可達(dá)1.19%，對(duì)提取物進(jìn)行性質(zhì)檢測，確定其為多糖成分。將100 mg/kg的紅茂草多糖通過刺激巨噬細(xì)胞的增殖和活化來提高CY抑制小鼠的吞噬能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復(fù)，在100～400 mg/kg范圍內(nèi)有劑量效應(yīng)。400 mg/kg的紅茂草多糖可以提高CY抑制小鼠細(xì)胞免疫反應(yīng)能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復(fù)，在100～400 mg/kg范圍內(nèi)有劑量效應(yīng)。紅茂草多糖通過刺激B淋巴細(xì)胞增殖的途徑來提高CY抑制小鼠細(xì)體液免疫反應(yīng)能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復(fù)，從而提高免疫低下小鼠的免疫功能。

天然藥物成分中絕大多數(shù)多糖，不僅對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用，而且能夠提高機(jī)體免疫功能，具有抗病毒、抗輻射、抗癌、降血糖、減肥和清除氧化自由基作用，其藥用潛力巨大。本研究為天然藥用植物紅茂草資源的深層次開發(fā)和利用，提供了一定的理論參考，也為該藥物今后的臨床應(yīng)用提供了可靠的試驗(yàn)依據(jù)。