己酸菌選育及在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

李 超，王金曉，馮鵬鵬，周韓玲，張翠英，2*，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津300457；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007；

3.宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓644007）

白酒是世界上六大蒸餾酒之一，距今約有2 000多年的歷史。白酒中主體成分為乙醇和水，約占98%，其余2%～3%為白酒風(fēng)味物質(zhì)，這些微量風(fēng)味物質(zhì)決定了白酒的品質(zhì)和價(jià)值。迄今為止，已鑒定出白酒中含有1 000多種風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、有機(jī)氮和含硫化合物等[1-2]。通過剖析酒內(nèi)香氣成分，研究其與工藝的關(guān)系，將白酒劃分為濃香型、醬香型、清香型、米香型等12種香型。濃香型白酒具有香味濃郁、口感柔和、尾凈綿長(zhǎng)的特點(diǎn)，消費(fèi)群體巨大，在各香型白酒中銷售占比最大，近幾年均維持在51%以上。

濃香型白酒采用窖池發(fā)酵，己酸乙酯是公認(rèn)的主體風(fēng)味物質(zhì)[3-4]，其對(duì)白酒的風(fēng)格和質(zhì)量具有關(guān)鍵作用。作為己酸乙酯合成的前體物質(zhì)—己酸，主要由窖泥中己酸菌合成。優(yōu)良己酸菌有助于窖泥質(zhì)量和基酒品質(zhì)的提升，因此，選育高產(chǎn)己酸菌株、基于產(chǎn)酸機(jī)制改善菌株產(chǎn)酸性能，有助于以更加科學(xué)的方式將己酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)，提高濃香型白酒優(yōu)級(jí)品率。

1 己酸菌的篩選

自1964年10月茅臺(tái)試點(diǎn)期間首次發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)窖底香的主要成分是己酸乙酯以來，國內(nèi)白酒行業(yè)相關(guān)科研工作者進(jìn)行了大量己酸菌篩選的工作[5-6]。此外，因己酸還能作為重要的能源前體物質(zhì)[7-8]、抗菌劑以及飼料添加劑[9]，國內(nèi)外能源行業(yè)相關(guān)科研工作者將己酸菌視為中鏈脂肪酸（C4～C8）生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)平臺(tái)，也進(jìn)行了大量己酸菌篩選工作[10-11]。目前，已經(jīng)篩選出的產(chǎn)己酸菌株主要包括梭菌屬（Clostridium）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、巨球型菌屬（Megasphaera）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等，具體信息見表1。

表1 己酸菌篩選及產(chǎn)酸情況Table 1 Screening and acid production of caproic acid-producing bacteria

梭菌屬（Clostridium），主要篩選自窖泥或污泥水，多為革蘭氏陽性菌（丁酸梭菌（C.butyricum）為革蘭氏陰性菌），嚴(yán)格厭氧，包括C.kluyveri、C.sporosphaeroides等菌株。菌落呈白色或灰白色圓形、扁平，表面光滑且周圍有較為明顯的透明圈，單菌呈桿狀且都能形成孢子。在這些菌中，克氏梭菌（C.kluyveri）最早由BARKER H A[22]從荷蘭代爾夫特運(yùn)河的泥漿中分離而來，已被視為中鏈脂肪酸生產(chǎn)的模式菌株。該菌株對(duì)底物的要求比較苛刻，僅能以乙醇、丙醇、丁醇等作為電子供體，不能利用葡萄糖、半乳糖等糖類物質(zhì)。

瘤胃菌科（Ruminococcaceae）同樣篩選自窖泥，菌落形態(tài)及單菌形態(tài)與梭菌屬相似。某些菌株細(xì)胞表面還有莢膜，周生鞭毛，可以游動(dòng)，如Ruminococcaceae H2。菌株CPB6則是近年來在濃香型白酒窖泥中分離到的一株可以利用乳酸高產(chǎn)己酸的菌株，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，己酸的最高生產(chǎn)速率可以達(dá)到5.29 g/（L·d），與之前報(bào)道的以乙醇作為底物生產(chǎn)己酸相比，生產(chǎn)能力明顯提高。據(jù)報(bào)道，類似于玉米秸稈、甘蔗廢料等木質(zhì)纖維素基質(zhì)可用于生產(chǎn)大量乳酸，基于這些研究，利用含乳酸的廢渣發(fā)酵生產(chǎn)己酸或許是一個(gè)較好的思路[5，23]。

埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）主要篩選自瘤胃，嚴(yán)格厭氧，革蘭氏陰性菌。在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（reinforced clostridial medium，RCM）上呈現(xiàn)微黃色、凸面、不透明的菌落，邊緣規(guī)則。不能形成孢子，沒有鞭毛，雙球菌生長(zhǎng)的球形微生物，單個(gè)細(xì)胞平均尺寸為0.8～1.2 μm[10]。其中菌株MH在以果糖為底物的培養(yǎng)基中加入乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉，可以合成C5～C8的中鏈脂肪酸，具有較強(qiáng)的碳鏈延伸能力[24]。

2 己酸合成途徑

厭氧微生物合成中鏈脂肪酸是依賴逆向β氧化作用，以低碳酸為底物與乙酰輔酶A縮合成β-羰基脂肪酰輔酶A，再經(jīng)過脫氫、脫水以及還原作用形成多兩個(gè)碳的?；o酶A[25]（圖1）。如克氏梭菌（C.kluyveri）利用乙醇和乙酸為底物產(chǎn)己酸時(shí)，乙醇發(fā)生氧化作用生成乙酰輔酶A，再與作為電子受體的乙酸基于逆向β氧化作用進(jìn)行兩次碳鏈延長(zhǎng)合成己酰輔酶A。

圖1 己酸合成途徑Fig. 1 Synthetic pathway of caproic acid

新生成的己酰輔酶A有3個(gè)去向，一是繼續(xù)參加下一輪的逆向β氧化循環(huán)生成更長(zhǎng)碳鏈的酰基輔酶A；二是經(jīng)過還原作用生成對(duì)應(yīng)醇類物質(zhì)；三是脫去輔酶A基團(tuán)生成己酸。己酸具體的合成途徑可以概括為三個(gè)步驟：

（一）乙酰輔酶A的生成：乙醇在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）作用下生成乙醛，又在乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALH）作用下進(jìn)一步生成乙酰輔酶A，并產(chǎn)生能量。全基因組測(cè)序結(jié)果得出克氏梭菌（C.kluyveri）中包含2個(gè)編碼乙醛脫氫酶和3個(gè)編碼乙醇脫氫酶的基因，將乙醇脫氫酶純化后經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)3種ADH同工酶，表明3種基因均能在克氏梭菌（C.kluyveri）體內(nèi)表達(dá)；2個(gè)Ald基因編碼的蛋白序列相同，因此無法確定2個(gè)基因的表達(dá)情況[26]。能夠利用葡萄糖、半乳糖、乳酸等底物的菌株則均是通過丙酮酸作為中間體生成乙酰輔酶A，然后發(fā)生逆向β氧化延長(zhǎng)碳鏈，合成中鏈脂肪酸。瘤胃菌科梭菌CPB6因缺失編碼乙醛脫氫酶的基因而不能利用乙醇合成乙酰輔酶A生成己酸，且與克氏梭菌（C.kluyveri）相比，編碼合成己酸的關(guān)鍵酶的基因也存在較大的差異[27]。

（二）丁酰輔酶A的生成（第一次鏈延伸）及丁酸形成：2個(gè)乙酰輔酶A首先縮合生成乙酰乙酰輔酶A，再經(jīng)過脫氫、脫水及還原作用相繼生成3-羥基丁酰輔酶A、丁烯酰輔酶A和丁酰輔酶A。在此過程中主要的作用酶為硫解酶、3-羥基?；o酶A脫氫酶、3-羥基?；o酶A脫水酶及?；o酶A脫氫酶。在一些產(chǎn)酸菌株中，編碼硫解酶的基因存在差異，如拜氏羧菌（Clostridium beijerinckii）、丁酸羧菌、瘤胃菌科梭菌CPB6中存在兩個(gè)編碼硫解酶的基因，克氏梭菌（C.kluyveri）基因組中存在3個(gè)編碼硫解酶的基因，分別為ThlA1、ThlA2、ThlA3，排列成為一個(gè)基因簇。楊嬌等[28]將3種編碼酶提取純化后進(jìn)行體外酶活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，基因Thl1對(duì)C4的催化效率相對(duì)較低，轉(zhuǎn)錄組分析得出，相比較于C2底物，ThlA2基因編碼的酶對(duì)C3、C4有更高的親和力，ThlA3基因則對(duì)短碳鏈C2親和力高，這與胡烈杰[29]的研究結(jié)果一致。編碼3-羥基酰基輔酶A脫氫酶的基因有Hbd1、Hbd2、PaaH1等基因，其中Hbd1與Hbd2基因存在于克氏梭菌（C.kluyveri）中。Hbd1基因?yàn)檫€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴型，對(duì)NADPH具有高催化活力；以乙酸作為底物，Hbd2基因的表達(dá)量并不高，而以丙酸為底物時(shí)表達(dá)量高，推測(cè)其作用底物可能不是3-羥基丁酰輔酶A[29]。編碼3-羥基酰基輔酶A脫水酶的基因有Crt1、Crt2，編碼烯酰輔酶A還原酶的相關(guān)基因有Bcd基因簇、EtfAB基因簇、Ter等。部分丁酰輔酶A與乙酸在?；o酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生反應(yīng)，脫去輔酶A基團(tuán)生成丁酸和新的乙酰輔酶A；克氏梭菌（C.kluyveri）中編碼?；o酶A轉(zhuǎn)移酶的主要基因?yàn)镃at3。

（三）己酰輔酶A的生成（第二次鏈延伸）及己酸形成：丁酰輔酶A與乙酰輔酶A發(fā)生縮合作用形成己酰輔酶A，中間產(chǎn)物包括3-酮基己酰輔酶A、3-羥基己酰輔酶A、己基-2-烯醇輔酶A，主要作用酶與首次碳鏈延伸參與酶一致。其中部分己酰輔酶A與丁酸在酰基輔酶A轉(zhuǎn)移酶作用下合成己酸。由于?；o酶A轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的催化活性，因此推測(cè)己酰輔酶A也可能通過與乙酸直接反應(yīng)來合成己酸，ZHU X等[23]以菌株CPB6為出發(fā)菌株，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在己酰輔酶A充足的情況下，分別加入乙酸、丁酸均能產(chǎn)生己酸，證實(shí)了這一猜測(cè)。也存在少量的己酰輔酶A參與下一輪的逆向β氧化，繼續(xù)進(jìn)行碳鏈的延伸。但是由于乙酰輔酶A在碳鏈延伸過程中會(huì)消耗大量的能量并伴隨氫氣（H2）的產(chǎn)生，同時(shí)己酸本身對(duì)己酸菌生長(zhǎng)性能及生理過程有抑制作用，在己酸濃度達(dá)到91.3 mmol/L時(shí)影響顯著[30]，受到能量代謝、H2壓力、己酸脅迫等方面的影響，進(jìn)一步的碳鏈延伸愈加困難[31]。

此外，有研究還發(fā)現(xiàn)，克氏梭菌（C.kluyveri）基因組中編碼中鏈脂肪酸合成作用酶的基因簇前存在一個(gè)氧化還原感應(yīng)全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白基因Rex，對(duì)中鏈脂肪酸的合成起到全局調(diào)控作用，其中crt1和cat3基因受到Rex基因的調(diào)控[32]。

3 己酸合成的改進(jìn)策略

3.1 發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成優(yōu)化

選擇適宜的發(fā)酵條件和配比合理的培養(yǎng)基是提高己酸菌產(chǎn)酸量行之有效的措施。WANG H等[33]為提高菌株CPB6產(chǎn)酸效率，通過響應(yīng)面優(yōu)化得出在以蔗糖13.30 g/L、乳酸22.35 g/L、丁酸16.48 g/L作為底物時(shí)，己酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到6.50 g/（L·d），較優(yōu)化前提升1.2 g/（L·d）以上。本實(shí)驗(yàn)室從某濃香型酒廠富集得到復(fù)合己酸菌液，對(duì)其產(chǎn)酸條件及培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度33 ℃、接種量5%、發(fā)酵時(shí)間11 d。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為乙酸鈉16.44 g/L、硫酸銨12.13 g/L、生物素0.13 g/L、碳酸鈣10.0 g/L、磷酸氫二鉀0.25 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、酵母浸粉6.25 g/L、乙醇25 mL/L、對(duì)氨基苯甲酸0.625 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)工藝下，獲得的己酸菌發(fā)酵液中己酸產(chǎn)量達(dá)18.93 g/L，比初始發(fā)酵工藝的發(fā)酵液（7.03 g/L）提高了169%[34]。

3.2 混菌發(fā)酵

研究表明，與純種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵利用微生物之間的合作和相互作用使微生物生長(zhǎng)和代謝更加的穩(wěn)定和高效[35]。目前，已研究的與己酸菌具備共同作用促進(jìn)己酸產(chǎn)量提升的菌株主要包括羧狀芽孢桿菌（Bacillus carboxylosus）、甲烷菌、放線菌及酵母菌。

（1）羧狀芽孢桿菌

兩種梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生交互作用，其中一種梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)物是另一種梭狀芽孢桿菌利用的底物，這種代謝在梭狀芽孢桿菌中非常普遍。永達(dá)爾梭菌（C.ljungdahlii）l利用克氏梭菌（C.kluyveri）產(chǎn)生的H2和CO2合成乙酸和乙醇，為其合成中鏈脂肪酸提供前體物質(zhì)[36]。在外源加入乙醇的條件下，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）S85、生黃瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）FD-1與克氏梭菌（C.kluyveri）共培養(yǎng)，利用纖維素產(chǎn)生琥珀酸和乙酸，為其產(chǎn)己酸提供前體物質(zhì)[37]。WEIMER P J等[38]將奶牛瘤胃中的混合菌與克氏梭菌（C.kluyveri）共培養(yǎng)，培養(yǎng)48～72 h內(nèi)己酸產(chǎn)量達(dá)到6.1 g/L。KIM S G等[39]以產(chǎn)丁酸的酪丁酸梭菌（Clostridium.tyrobutyricum）和可利用乙酸為底物產(chǎn)己酸的己酸巨球型菌（Megasphaera hexanoica）依次進(jìn)行發(fā)酵，并結(jié)合使用纖維膜生物反應(yīng)器，己酸質(zhì)量濃度增加至10.08 g/L，最高的生產(chǎn)速率為0.69 g/（L·h）。

（2）甲烷菌

產(chǎn)甲烷菌可以與己酸菌發(fā)生種間氫轉(zhuǎn)移作用，己酸菌在厭氧呼吸中產(chǎn)生的H2和CO2可以作為產(chǎn)甲烷菌利用的底物，產(chǎn)甲烷菌通過氫代謝電子調(diào)節(jié)作用，從熱力學(xué)角度為己酸菌代謝碳化合物提供有利條件。早期有研究表明，產(chǎn)己酸的菌株是梭狀芽孢桿菌與甲烷菌的共棲種，二者分離后各自都只能產(chǎn)乙酸、丁酸、CO2和H2，直到后來不斷有產(chǎn)己酸純種分離出來。通過宏基因組分析得到濃香型白酒窖泥中甲烷菌種群豐度約為19%，包含7.25%的氫甲烷菌，并存在多種與甲烷形成相關(guān)的關(guān)鍵基因，推測(cè)氫甲烷菌的存在同己酸菌發(fā)生種間氫轉(zhuǎn)移，利于提高己酸的產(chǎn)生[40]，生產(chǎn)實(shí)踐也證明甲烷菌的加入促進(jìn)了己酸的產(chǎn)生[41]。

（3）放線菌

郭威等[42-43]通過篩選，從窖泥中篩選獲得一株優(yōu)良放線菌白骨壤鏈霉菌（Streptomyces avicenniae）GW01，該菌株單獨(dú)自身不能產(chǎn)己酸，與己酸菌混合培養(yǎng)發(fā)酵比己酸菌純種發(fā)酵產(chǎn)酸量提高約31%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其與產(chǎn)酸相關(guān)的促進(jìn)因子可能是一種黑色素。

（4）酵母菌

嵇翔等[44]將克氏梭菌（C.kluyveri）與釀酒酵母共培養(yǎng)，己酸產(chǎn)量由最初純培養(yǎng)的6.35 g/L提升至7.09 g/L，初步探討了其作用機(jī)制，為酵母菌的存在改善了厭氧環(huán)境，提高了乙酸及丁酸的轉(zhuǎn)化率。

3.3 菌株改造及誘變

為了改善己酸的合成，研究者希望通過菌株改造的方法尋找突破口。以大腸桿菌（Escherichia coli）為出發(fā)菌株，LIM J H等[45]通過敲除Pta基因以維持氧化還原平衡，過表達(dá)編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因AtoB、3-羥基?；o酶A脫氫酶的基因Hbd、烯酰輔酶水合酶的基因Crt、反式烯酰輔酶A還原酶的基因Ter、硫酯酶的基因TESB，構(gòu)建了產(chǎn)丁酰輔酶A的菌株。在此基礎(chǔ)上，再次外源引入鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）中編碼β-酮硫解酶的基因BktB并使用菌株M.elsdeniiMH中編碼乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因Mhact替代AtoB，構(gòu)建可以以葡萄糖為底物合成己酸的工程菌，其發(fā)酵36 h時(shí)己酸產(chǎn)量最高為528 mg/L[46]。

以馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）為出發(fā)菌株，過表達(dá)基因AtoB、BktB、Crt、Hbd、MCT1、Ter和TES1獲得菌株H4A，以半乳糖為唯一碳源發(fā)酵48 h時(shí)，己酸產(chǎn)量為145 mg/L?；駻toB編碼的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可以實(shí)現(xiàn)乙酰乙酰輔酶A的快速積累，但由于該酶具有強(qiáng)逆轉(zhuǎn)活性，反而引起后期前體物質(zhì)乙酰乙酰輔酶A的不足，菌株H4A產(chǎn)酸并不穩(wěn)定。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中編碼丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)酰酶的基因MCT1能夠同時(shí)利用乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A來緩慢增加乙酰乙酰輔酶A的含量，反應(yīng)可逆性非常低，以其代大腸桿菌的基因AtoB則可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酸穩(wěn)定，己酸產(chǎn)量為142 mg/L[47]。

以賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）為出發(fā)菌，轉(zhuǎn)染SigB突變基因，獲得耐高乙醇和低pH值脅迫的優(yōu)良己酸產(chǎn)生菌L.fusiformis-pBE3-ep-SigB，重組菌株的己酸產(chǎn)量達(dá)到2.54 g/L，是出發(fā)菌株產(chǎn)量的271.68%[48]。

4 己酸菌在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

窖泥作為己酸菌的棲息地，其微生物群系豐富，錯(cuò)綜復(fù)雜。上千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明了窖池窖齡與白酒品質(zhì)密切相關(guān)，老窖才能出好酒?？茖W(xué)的數(shù)據(jù)揭示了老窖泥中微生物群系豐度高，己酸菌為重要優(yōu)勢(shì)種群之一[49-50]。傳統(tǒng)人工窖泥需要經(jīng)過20年以上的積淀才能釀造出一般品質(zhì)以上的酒，人工窖泥中加入窖泥培養(yǎng)菌劑能夠有效促進(jìn)窖泥老熟，有利于窖泥中有益功能微生物的快速富集，進(jìn)而促進(jìn)乙醇和其他酯類物質(zhì)的積累，獲得高品質(zhì)窖泥。魯少文等[51]在人工窖泥中加入能夠利用乳酸合成己酸的瘤胃梭菌，35 d即獲得最高己酸乙酯產(chǎn)量，同時(shí)形成了良好的微生物群落。瀘州老窖[52]、賒店酒廠[53]在人工窖泥中使用類似窖泥培養(yǎng)菌液，所產(chǎn)酒質(zhì)優(yōu)良，己酸乙酯含量與老窖泥所產(chǎn)酒相近。

長(zhǎng)時(shí)間的生產(chǎn)發(fā)酵過程，也使得窖泥中營養(yǎng)物質(zhì)消耗或失調(diào)、乳酸亞鐵及乳酸鈣等有害物質(zhì)累積、有益功能微生物數(shù)量減少，需要有效的養(yǎng)護(hù)才能保證窖泥的質(zhì)量。己酸菌對(duì)窖池養(yǎng)護(hù)起關(guān)鍵作用，優(yōu)良己酸菌培養(yǎng)的窖泥生產(chǎn)出的濃香型白酒，不僅主體香成分己酸乙酯含量高，而且香氣細(xì)膩合適，口味柔和干凈[54]。生產(chǎn)實(shí)踐證明，窖泥中添加以己酸菌為主的窖泥培養(yǎng)菌劑對(duì)窖泥功能微生物數(shù)量[55]、白酒中己酸乙酯含量、優(yōu)級(jí)率提升效果明顯。桑其明等[56]使用己酸菌、甲烷桿菌等混合制劑養(yǎng)護(hù)窖泥，改善了窖泥板結(jié)退化的現(xiàn)象，己酸乙酯含量增加164%，窖香較明顯且酒體變得較醇厚、干凈。洋河酒廠將綿柔型窖泥功能菌菌液用于窖泥，發(fā)酵成熟的窖泥中以己酸菌為代表的功能菌數(shù)量達(dá)到108個(gè)/g以上，解決了以往改造后的窖池第一排無優(yōu)級(jí)酒的狀況，同時(shí)，出酒率達(dá)到了34%以上，比同期平均出酒率提高近3.5%，每年新增經(jīng)濟(jì)效益1 400～2 000萬元[57]。同樣的技術(shù)手段也用于景芝酒廠[58]、豐谷酒廠[59]等，均取得良好的效果。

5 結(jié)論與展望

己酸菌是窖泥培養(yǎng)菌劑的基礎(chǔ)菌株，目前窖泥培養(yǎng)菌劑的使用在不少酒廠取得良好收效，但也存在己酸乙酯產(chǎn)量不高、酒質(zhì)提升不明顯等問題，究其原因在于所選用的己酸菌產(chǎn)酸性能不佳，因此，優(yōu)良己酸菌的選育以及產(chǎn)酸性能的改善仍是今后研究的重點(diǎn)。

菌種分離仍然是獲得高產(chǎn)己酸菌的基本手段，但己酸菌多為嚴(yán)格厭氧菌，分離培養(yǎng)困難，已經(jīng)分離出的純種數(shù)量非常有限。針對(duì)這些特殊生境中的微生物，可以借助高通量培養(yǎng)技術(shù)、原位培養(yǎng)等分離方法，結(jié)合生物信息學(xué)獲知微生物生理功能特征，實(shí)現(xiàn)有效分離。

通過混菌發(fā)酵或分子改造的方法也是改善己酸生產(chǎn)的有效策略。從已改造的菌株來看，逆向β氧化途徑可以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌和酵母菌中的異源表達(dá)，克服了厭氧環(huán)境的限制，但菌株的己酸產(chǎn)量很低，難以滿足工業(yè)化的生產(chǎn)應(yīng)用。大腸桿菌、酵母菌等模式菌株對(duì)己酸敏感性強(qiáng)，較低濃度的己酸即抑制了菌株的生長(zhǎng)，導(dǎo)致了產(chǎn)酸不能持續(xù)進(jìn)行。因此，研究己酸對(duì)菌株的抑制機(jī)制，通過篩選或分子改造的方法獲得己酸高耐受性菌株意義重大。梭菌屬（Clostridium）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等自身就能合成己酸，相比于一些模式菌株，原則上應(yīng)該是更好的出發(fā)菌株。據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，這些菌株的改造目的多為中鏈醇的生產(chǎn)，鮮有關(guān)于中鏈脂肪酸合成方面的報(bào)道。中鏈醇在這些厭氧生物中合成也是經(jīng)逆向β氧化途徑，這為通過改造厭氧微生物提高己酸產(chǎn)量提供了可靠參考。

總之，通過選育優(yōu)良菌株、采用不同措施提高產(chǎn)酸性能，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲得“增己”效果顯著、適用廣泛的菌劑，并最終實(shí)現(xiàn)規(guī)?；膽?yīng)用，這將對(duì)提升濃香型白酒的品質(zhì)有極大的推動(dòng)作用。