培補二天膏對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及心臟重構(gòu)的影響

戴斌 陳競緯 張國興 吳瑛瀅

1.南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州醫(yī)院 江蘇，蘇州 215000 2.蘇州大學

炎性細胞因子主要與機體免疫功能和炎癥反應有關(guān)，已被證實是多種心血管疾病的起始、進展和臨床意義的關(guān)鍵因素。促炎細胞因子能夠刺激平滑肌細胞增殖、促進血管活性物質(zhì)釋放、引起內(nèi)皮功能紊亂[1]，同時還能促進心肌細胞肥大、間質(zhì)纖維化，參與疾病進程[2]，可見炎性細胞因子與高血壓病的發(fā)生發(fā)展和其靶細胞損害均有關(guān)。抑制促炎細胞因子的分泌，是否能改善高血壓病患者的癥狀和預后，是目前研究的方向。培補二天膏是我院陳競緯主任醫(yī)師結(jié)合葉天士、秦伯未膏方用藥經(jīng)驗及自身臨證經(jīng)驗所創(chuàng)，主要針對老年高血壓病患者。方以天麻鉤藤飲及六味地黃丸為基礎(chǔ)，選取山萸肉、菟絲子、天麻，牛膝、白術(shù)、砂仁、酸棗仁等藥物，其中重用山萸肉、菟絲子、天麻為君，起到補肝腎脾、化痰活血的作用，在臨床應用過程中控制血壓效果頗佳[3]。本研究擬進一步觀察其對自發(fā)性高血壓大鼠 （spontaneously hypertensive rats，SHR）血壓、炎性細胞因子和心臟重構(gòu)的影響，探究其降壓及改善心臟重構(gòu)的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SHR大鼠50只，12月齡，體重（382±29）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 ［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （京）2016-0006］；清潔級雄性Wister kyoto（WKY）大鼠9只，12月齡，體重（357±32）g，來自日本奈良醫(yī)科大學第二生理學科。實驗在蘇州大學實驗動物中心［實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0045］完成。

1.2 藥物與試劑 培補二天膏主要成分：天麻150g、川牛膝150g、白術(shù)300g、砂仁50g、五味子150g、酸棗仁150g、山萸肉300g、菟絲子100g、太子參150g、綠萼梅100g、藏紅花1g、三七片150g、姜半夏150g、澤瀉150g、黃連60g、麥冬150g、焦山楂120g、陳皮100g、東阿阿膠250g、龜甲膠100g，以上藥物均購于蘇州春暉堂，膏方于實驗前1周由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院中藥房制備完成。厄貝沙坦片（商品名：安博維，規(guī)格：150mg/片）購于杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司 （批號：8A157）；大鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、大鼠IL-2 ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒均購于聯(lián)科生物（批號：EK301B/3、EK302/2、EK306/3、EK382HS）。

1.3 實驗儀器 XH100尾動脈血壓測定儀購于北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；MedLab-U/4C501數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)購于上海康為醫(yī)療科技發(fā)展有限公司；冷凍臺式離心機為美國Thermo公司產(chǎn)品；酶標儀購于南京寶城生物技術(shù)有限公司；RM2016病理切片機購于上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡和Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購于日本尼康公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥 將SHR編號后測量動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）作為實驗前基礎(chǔ)血壓，剔除其中SBP＜140mmHg的SHR后，將余下SHR分為5組：陰性對照組，膏方低、中、高劑量組，厄貝沙坦組；另將同月齡WKY大鼠作為WKY組。實驗開始第2周陰性對照組1只大鼠突發(fā)中風偏癱，遂剔除；最終各組數(shù)量為WKY組9只，膏方低、中、高劑量組各組9只，厄貝沙坦組10只，陰性對照組7只。按人-大鼠體表面積比值折算大鼠的等效劑量，臨床等效劑量=臨床用藥劑量×等效劑量系數(shù)，70kg成人與400g大鼠按體表面積折算的等效劑量系數(shù)為0.027，低、中、高劑量組為臨床等效劑量組的濃度的0.5、1、3倍。即膏方中劑量組大鼠每kg體重用藥劑量=人 （70kg）用藥劑量×0.027/0.4。

計算得出，膏方低、中、高劑量組大鼠給藥量分別為0.58g/（kg·d）、1.15g/（kg·d）、3.46g/（kg·d）， 厄貝沙坦組按上述公式計算得出給藥量為10.13mg/（kg·d），以溫蒸餾水稀釋成混懸液，每只灌胃總量約2mL；陰性對照組及WKY組每日以溫蒸餾水10mL/（kg·d），每日每只灌胃總量約2mL。

1.4.2 SBP測定 利用無創(chuàng)尾動脈血壓測定儀測定大鼠尾動脈SBP，所有大鼠分別于給藥前、給藥后每周的周日上午10∶00（或服藥后0.5～1h）測定血壓，每次血壓重復測定3次，取平均值作為大鼠的尾動脈SBP。

1.4.3 ELISA檢測血清炎性細胞因子水平 末次給藥后，所有大鼠禁食12h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，于工作臺上剪開腹腔，腹主動脈取血約10mL，4℃靜置30min分層，4℃下3 000r/min離心15min，分離血清，置56℃水浴滅活30min，分裝后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?以ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。

1.4.4 心臟重量指數(shù)（heart mass index，HMI）檢測各組大鼠取血后迅速分離心臟，在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中漂洗，除去血液，去除大血管殘根和結(jié)締組織，濾紙吸干后稱重，HMI=心臟重量/體重。

1.4.5 心肌病理形態(tài)觀察 稱重完成后的大鼠心臟于4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋，于左心室部位行連續(xù)3μm切片，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后鏡下觀察大鼠心肌細胞病理變化。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，WKY組與陰性對照組SHR比較采用兩獨立樣本t檢驗，SHR各組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實驗前后SBP比較 給藥前，各給藥組SHR與陰性對照組間SBP差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），WKY組大鼠SBP明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，實驗第1周后，膏方高劑量組和厄貝沙坦組SBP明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；實驗第2周后，膏方高劑量組及厄貝沙坦組SBP仍然低于陰性對照組（P＜0.01，P＜0.05）；實驗第3周后，膏方高劑量組SHR血壓出現(xiàn)升高，且與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而厄貝沙坦組SBP仍低于陰性對照組（P＜0.01）；實驗第4周后，膏方中、高劑量組及厄貝沙坦組明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。見表1。實驗第1周，膏方低劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），中、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗第2周，膏方各劑量組與厄貝沙坦組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗第3周，膏方低、中劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗第4周，膏方低劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），中、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠實驗前后SBP比較（mmHg）Tab.1Comparison of SBP among groups before and after the experiment（mmHg）

表2 各組大鼠血清IL-1β水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum IL-1β levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2 各組大鼠血清炎性細胞因子水平比較

2.2.1 各組大鼠各組大鼠血清IL-1β水平比較 實驗4周后，陰性對照組血清IL-1β水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，各給藥組SHR血清IL-1β水平均降低（P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組血清IL-1β水平均升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

2.2.2 各組大鼠血清IL-2水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清IL-2水平高于WKY組（P＜0.05）。與陰性對照組比較，膏方各劑量組和厄貝沙坦組IL-2水平明顯降低（P＜0.01）。與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組IL-2水平升高，其中低劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而中、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表3。

2.2.3 各組大鼠血清IL-6水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清IL-6水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方各劑量組和厄貝沙坦組SHR血清IL-6水平降低（P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組IL-6水平均升高，其中低、中劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表4。

表3 各組大鼠血清IL-2水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum IL-2 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表4 各組大鼠血清IL-6水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.4 Comparison of serum IL-6 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2.4 各組大鼠血清TNF-α水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清TNF-α水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方低、中劑量組TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而膏方高劑量組及厄貝沙坦組TNF-α水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組TNF-α水平都明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。 見表5。

2.3 各組大鼠心臟重量、體重及HMI比較 實驗4周后，各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。陰性對照組心臟重量及HMI均明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方高劑量組及厄貝沙坦組心臟重量及HMI降低（P＜0.05）。與厄貝沙坦組比較，膏方低劑量組HMI升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他各劑量組心臟重量和HMI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表6。

2.4 各組大鼠心肌病理形態(tài)觀察 光鏡下觀察可見陰性對照組心肌細胞肥大，核增大，排列紊亂，部分心肌細胞壞死；間質(zhì)纖維組織增生，大量炎性細胞浸潤，部分脂肪變性。膏方低劑量組心肌細胞肥大，個別細胞核增大，排列紊亂；大量炎性細胞浸潤，纖維組織增生；中劑量組心肌細胞中度肥大，排列較整齊，炎性細胞浸潤較陰性對照組及低劑量組明顯減少，少量纖維組織增生；高劑量組心肌細胞肥大減輕，排列較整齊；間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯少于陰性對照組，可見少量纖維增生。厄貝沙坦組心肌細胞輕度肥大，細胞排列緊密整齊；間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯減少，未見明顯纖維增生。見圖1。

表5 各組大鼠血清TNF-α水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.5 Comparison of serum TNF-α levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表6 各組大鼠心臟重量、體重及HMI比較Tab.6 Comparison of heart weight,weight and HMI in each group

3 討論

高血壓病是一種常見的疾病，病因及其病理生理尚不明確。在傳統(tǒng)醫(yī)籍中并沒有該病的記載，因其常伴隨頭暈頭脹或頭痛等癥狀，故多將其歸為傳統(tǒng)醫(yī)學的“眩暈”“頭痛”的范疇。中醫(yī)常認為它與稟賦不足、情志不遂、飲食失宜、勞倦過度等因素有關(guān)，其病機總屬本虛標實，虛者常為肝腎陰虛、脾虛不運，實者常為痰濁、血瘀、氣郁、肝風等等，其中主要責之于肝、腎、脾。對于老年高血壓病患者而言，病機或有標實顯著，然本虛甚者更占多數(shù)?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸埃ㄕ煞颍┪灏四I氣衰，發(fā)墮齒槁……（女子）五七，陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮……”說明脾腎等臟腑功能會隨年齡增長而逐漸發(fā)生不可逆的衰退，這也是老年高血壓病患者的本質(zhì)特征。膏方以其突出的滋補特性更適宜此類以本虛為主的輕中度老年高血壓患者。培補二天膏是以六味地黃丸與天麻鉤藤飲為基礎(chǔ)方，結(jié)合吳門醫(yī)派膏方經(jīng)驗創(chuàng)新而來，以補肝腎脾、化痰活血等治法為主，契合老年高血壓病患者的根本病機，在臨床治療中也取得較好療效。本研究選取的實驗動物為高齡SHR或WKY大鼠，也是為了盡可能貼近膏方的適用人群。

近年來的研究顯示，低度全身性炎癥對高血壓的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用[4]，而炎性細胞因子在其中扮演著重要的角色。作為促炎細胞因子，IL家族分子已被證實能夠通過不同機制升高血壓，如IL-1β能夠刺激血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖，引起血管內(nèi)皮細胞形態(tài)變化，改變細胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)，并能夠增加VSMC細胞膜鈣離子通透性，促進鈣離子內(nèi)流，促使血壓升高[5]。IL-2能夠促進單核細胞釋放血管活性物質(zhì)，如血栓素A2等；同時可產(chǎn)生氧自由基，直接引起平滑肌收縮，或抑制內(nèi)皮依賴性舒張因子表達或?qū)е缕涫Щ?，最終升高血壓[5]。IL-6則通過增加白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，提高血管阻力[6]；還能夠引起內(nèi)皮功能紊亂[7]，促進平滑肌增殖，提高細胞內(nèi)鈣離子濃度，加強血管收縮[8]；同時能夠上調(diào)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受體表達，發(fā)揮縮血管作用[9]。

圖1 各組大鼠心肌細胞病理結(jié)果比較（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological results of rat myocardial cells in each group（HE staining）

另一方面，心臟重構(gòu)作為高血壓病的靶器官損害，其病理改變主要包括心肌細胞肥大[10]、心肌細胞纖維化與凋亡[11]、心肌間質(zhì)纖維化[12]和冠狀動脈內(nèi)膜玻璃樣變、內(nèi)皮增生、中膜增厚、外膜纖維化[13]，以上病理生理過程也與IL家族密不可分。IL-6過表達可能通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 介導的 基質(zhì) 金屬蛋 白 酶2（matrix metalloprotein2，MMP2）/MMP3信號通路，誘導肌纖維母細胞增殖、分化和纖維化[14]。而IL-6拮抗劑能使特定培養(yǎng)基中心肌細胞表面積減少，并抑制成纖維細胞增殖，可見IL-6有促進心肌細胞肥大，誘導細胞間質(zhì)纖維化的作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 （cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）誘導小鼠心肌細胞凋亡[16]。白細胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）介導的髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性信號通路主要激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[17]， 從而活化組織中的MMP，促進間質(zhì)纖維化，同時通過反饋調(diào)節(jié)AngⅡ的合成，間接影響心室重構(gòu)[18]。IL-18能迅速誘導MMP基因（尤其是MMP-9）表達，促進心肌細胞間質(zhì)降解，導致心肌細胞間質(zhì)纖維化[19]；并且能夠增強TNF-α誘導的心肌細胞凋亡，還能夠誘導心臟內(nèi)皮細胞死亡[20]。此外最重要的一點是，高血壓心臟重構(gòu)過程與血壓直接相關(guān)，血壓的降低能夠直接改善心臟重構(gòu)。

作為本研究的陽性對照藥物，厄貝沙坦通過拮抗AngⅡ1型受體發(fā)揮降壓療效，且能抑制AngⅡ。NF-κB信號通路作為炎性細胞因子合成的關(guān)鍵通路[21-22]，能夠被AngⅡ迅速激活[23]。因此通過抑制AngⅡ，厄貝沙坦能夠有效地抑制促炎細胞因子的生成，通過控制血壓、抑制炎癥反應，改善心臟重構(gòu)。

本研究結(jié)果表明中、高劑量的培補二天膏具有明確的降壓療效，高劑量膏方能夠減低大鼠HMI，且病理學顯示膏方高劑量組及厄貝沙坦組心肌細胞肥大減輕，間質(zhì)炎性細胞浸潤較陰性對照組及膏方低劑量組明顯減少，可見高劑量膏方能夠改善老年SHR的心肌炎癥反應，減輕心肌細胞肥大，由此提示高劑量膏方能夠改善SHR心臟重構(gòu)。血清炎性細胞因子水平的檢測則提示，培補二天膏能夠不同程度降低SHR血清IL-2、IL-1β、IL-6水平，而只有高劑量膏方能夠降低血清 TNF-α水平。由上可以推測，培補二天膏對IL家族的干預較明顯，而對TNF-α的影響相對較小。

綜上所述，本研究提示培補二天膏降低血壓的療效確切，而且能夠降低SHR血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平，高劑量時還能夠改善SHR心臟重構(gòu)，由此推斷其對心臟重構(gòu)的改善作用可能是通過降低血壓及炎性細胞因子水平實現(xiàn)的。