基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討半夏治療直腸癌的作用機(jī)制

杭州市第三人民醫(yī)院 杭州 310002

直腸癌（rectal cancer）是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。由于現(xiàn)代人群飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，直腸癌發(fā)病年齡更加趨于年輕化[2-3]。在過(guò)去的8年里，中老年人患者就診率最高，男性患者就診率約為女性的1.5倍[4]。直腸癌的癥狀主要以便中帶血、腹部不適、大便習(xí)慣改變和腹部包塊為主，其次為貧血和其他復(fù)合癥狀[5-6]。本病治療困難，預(yù)后不良，西醫(yī)治療以根治性手術(shù)、姑息性手術(shù)、放化療和靶向治療為主，手術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)率高，而其他治療均存在相應(yīng)的局限性[7-9]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療逐漸成為直腸癌防治的新方案，研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功效，進(jìn)而能夠達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展、減輕癥狀以及提高生活質(zhì)量的目的[10-12]。

中醫(yī)認(rèn)為，直腸癌是由于濕熱瘀毒等病理產(chǎn)物蓄積體內(nèi)，導(dǎo)致臟腑功能紊亂而發(fā)，通常應(yīng)用化痰除濕、清熱解毒、消腫散結(jié)等法治療。各中醫(yī)大家在治療直腸癌時(shí)，大量使用茯苓、白術(shù)、半夏、陳皮等利水滲濕、活血化瘀類(lèi)藥物，同時(shí)輔以黨參、黃芪等扶正藥物[13-15]。半夏又名地文、裂刀草，屬天南星科，主要分布在四川、湖北、江蘇等地，辛、溫、有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、消痞散結(jié)、解毒消腫等功效。由于中藥所含成分多樣，作用機(jī)制復(fù)雜，故很難確定其有效化學(xué)成分。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合分析半夏的組成成分，探索半夏與直腸癌的共同靶點(diǎn)，并分析涉及的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，以剖析半夏治療直腸癌的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究成果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 篩選半夏的關(guān)鍵化學(xué)成分 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）檢索半夏所有的有效成分，共收集到116種化合物，再以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)化合物的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選。OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機(jī)體吸收進(jìn)入血液循環(huán)的相對(duì)量和速率，DL反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義。

1.2 篩選半夏-直腸癌共同作用靶點(diǎn) 利用TCMSP搜索半夏關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）查詢(xún)與靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人類(lèi)基因名稱(chēng)，再與通過(guò)基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（genome annotation database platform，Gene Cards）（https://www.genecards.org/）、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳 （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）篩選出的直腸癌靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病靶點(diǎn)基因。

1.3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化 為了研究半夏治療直腸癌的作用機(jī)制，本研究將半夏-直腸癌的共同化學(xué)成分和共同靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，將藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，關(guān)鍵化學(xué)成分和疾病靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊來(lái)表示。

1.4 蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將半夏與直腸癌的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/Version 10.5），選擇研究物種為人類(lèi)（Homo sapiens），設(shè)PPI評(píng)分＞0.7，得到PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，下載PPI關(guān)系圖，并篩選排名前15的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通過(guò)Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢(xún)藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因的基因身份（identity，ID）。利用R語(yǔ)言安裝Bioconductor平臺(tái)相關(guān)安裝包，設(shè)置P值=0.05，Q值=0.05，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 半夏中化學(xué)成分的篩選 通過(guò)TCMSP獲得半夏的有效化合物共116種，再經(jīng)OB＞30%、DL＞0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到半夏的關(guān)鍵化學(xué)成分13種，包括卡維丁、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、剛丹酸、環(huán)烯醇等。見(jiàn)表1。

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)Gene Cards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索直腸癌的靶點(diǎn)基因，輸入 “Rectal cancer”，獲取相關(guān)性評(píng)分大于5的基因共1 135個(gè)，將半夏與直腸癌的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到半夏-直腸癌的共同靶點(diǎn)共32個(gè)，并通過(guò)R語(yǔ)言繪制Venn圖。見(jiàn)圖1。記錄共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的半夏關(guān)鍵化學(xué)成分，最終得到半夏-直腸癌的關(guān)鍵化學(xué)成分共10個(gè)，分別為24-乙基膽甾醇、卡維丁、黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、剛丹酸、松柏苷、10，13-二十碳二烯、（3S，6S）-3-（芐基）-6-（4-羥基芐基） 哌嗪-2，5-醌、β-D-核呋喃糖苷、黃嘌呤-9。半夏-直腸癌的共同靶點(diǎn)基因分別為孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、雄激素受體 （androgen receptor，AR）、 雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、 前列腺素G/H合酶1（prostaglandin G/H synthase1，PTGS1）、 前 列 腺 素 G/H 合 酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、5-羥色胺受體3A （5-hydroxytryptamine receptor 3A，HTR3A）、維甲酸受體RXR-α （retinoic acid receptor RXR-α，RXRA）、beta-2腎上腺素受體（beta-2 adrenergic receptor，ADRB2）、鈉依賴(lài)性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodiumdependent serotonin transporter，SLC6A4）、絲氨酸蛋白酶1 （serine protease 1，PRSS1）、 核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 （nuclearfactorkappa B p65，NF-κB p65/RELA）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、B細(xì)胞淋巴瘤－2（B cell lymphoma－2，BCL－2）、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma-2-associated X protein，BAX）、低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8，CASP8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，CASP9）、腫瘤蛋白63（tumor protein 63，TP63）、 缺氧誘導(dǎo)因子1-α （hypoxia-inducible factor 1-α，HIF1A）、G2/有絲分裂特異性細(xì)胞周期蛋白B1（G2/mitotic-specific cyclin B1，CCNB1）、細(xì)胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）、 胰島素樣生長(zhǎng)因子2 （insulin-like growth factor 2，IGF2）、 細(xì)胞色素C （cytochrome C，CYCS）、 花生四烯酸12-脂加氧酶 （arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）、活性蛋白-1（activator protein-1，AP-1/JUN）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinasetype plasminogen activator，PLAU）、 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）。

表1 篩選后的半夏有效成分Tab.1 The active ingredients of Rhizoma pinelliae after screening

圖1 半夏-直腸癌靶點(diǎn)基因匹配情況Fig.1 Rhizoma pinelliae-rectal cancer target gene matching

2.3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件將藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。見(jiàn)圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將半夏-直腸癌共有的32個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，篩選PPI關(guān)系評(píng)分＞0.7的蛋白關(guān)系，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中藍(lán)色連線代表基因共進(jìn)化證據(jù)，紅色連線代表基因融合證據(jù)，黃色連線代表文本挖掘證據(jù)等。見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)包括32個(gè)節(jié)點(diǎn)，91條邊，其中PPI關(guān)系評(píng)分≥0.99的互作蛋白為JUNFOS、CASP8-CASP3、CCNA2-CCNB1、CASP9-CYCS、RXRA -PPARG、VEGFA -HIF1A、BCL2-CASP8、CASP3-CYCS、AKT1-CASP9、CASP8-CASP9、AKT1-ESR1，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要。通過(guò)計(jì)算每個(gè)基因連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，找出前15個(gè)PPI核心基因，為AKT1、JUN、CASP3、MMP9、VEGFA、AR、ESR1、PTGS2、CASP8、BAX、BCL-2、CYCS、FOS、PPARG、RELA，這些即為半夏治療直腸癌的核心基因。見(jiàn)圖3、4。

圖2 半夏藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分與直腸癌作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Target networks of Rhizoma pinelliae drugs-key chemical components and rectal cancer

圖3 PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI relationship network

圖4 PPI核心基因Fig.4 PPI core genes

2.5 GO功能富集分析 結(jié)果顯示共涉及66個(gè)功能，排名靠前的主要為核受體活性調(diào)節(jié)（包括6個(gè)靶點(diǎn)PGR、RXRA、AR、AHR、ESR1、PPARG）， 轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)，配體直接調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合 （共6個(gè)靶點(diǎn)PGR、RXRA、AR、AHR、ESR1、PPARG）， 類(lèi)固醇激素受體活性（共5個(gè)靶點(diǎn)PGR、RXRA、AR、ESR1、PPARG），RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（共6個(gè)靶點(diǎn)AR、FOS、AHR、JUN、ESR1、PPARG），DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性（共8個(gè)靶點(diǎn)PGR、AR、RELA、FOS、TP63、HIF1A、JUN、ESR1），半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡過(guò)程 （共3個(gè)靶點(diǎn)CASP3、CASP9、CASP8），RNA聚合酶Ⅱ基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（共3個(gè)靶點(diǎn)AR、AHR、ESR1），轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合（共3個(gè)靶點(diǎn)RELA、AHR、ESR1），激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（共4個(gè)靶點(diǎn)RELA、FOS、JUN、PPARG）。見(jiàn)圖5。說(shuō)明半夏可以通過(guò)多種生物學(xué)調(diào)控過(guò)程發(fā)揮治療直腸癌的作用。

圖5 半夏-直腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程富集分析Fig.5 Enrichment analysis of GO biological process for Rhizoma pinelliae-rectal cancer key targets

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，半夏治療直腸癌的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路有104條，主要通路涉及乙肝通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、小細(xì)胞肺癌通路、細(xì)胞凋亡通路、麻疹通路、人類(lèi)免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV1）感染通路、大腸癌通路、多種凋亡通路、EB病毒感染通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鉑劑耐藥通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17， IL-17）信號(hào)通路、前列腺癌通路等。見(jiàn)圖6。

圖6 半夏-直腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG代謝通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway for Rhizoma pinelliae-rectal cancer key targets

3 討論

本研究通過(guò)篩選半夏關(guān)鍵化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，與直腸癌在人體所涉及的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)半夏中的關(guān)鍵化學(xué)成分可以通過(guò)多種靶點(diǎn)基因、多種信號(hào)通路對(duì)直腸癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。半夏塊莖含有揮發(fā)油，內(nèi)含多種化學(xué)成分，本研究檢索出與直腸癌相關(guān)的半夏有效化學(xué)成分共10種，包括卡維丁、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、剛丹酸、環(huán)烯醇等?？ňS丁具有顯著的抗腫瘤功效，此外還具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗病毒作用[16]。黃芩素亦具有抗腫瘤作用，同時(shí)還能夠抗菌、抗病毒、抑制炎癥反應(yīng)、利膽、抗凝和抗血栓[17-18]。黃芩苷具有多方面的藥理活性，能夠減輕組織的缺血再灌注損傷，清除氧自由基，調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[19]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷在抗腫瘤、抗HIV及治療心腦血管疾病等方面都具有重要價(jià)值[20-21]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，很多植物中均含有β-谷甾醇，可降低血液中膽固醇的含量，常用于治療高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化[22]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用[23]。松柏苷具有抗氧化活性和抑菌活性，能夠清除2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，還可用于抗腫瘤治療[24]。 本研究通過(guò)PPI關(guān)系分析，得到15個(gè)PPI核心基因，為AKT1、JUN、CASP3、MMP9、VEGFA、AR、ESR1、PTGS2、CASP8、BAX、BCL-2、CYCS、FOS、PPARG、RELA，這些靶點(diǎn)基因即為半夏治療直腸癌的核心基因。

進(jìn)一步對(duì)靶標(biāo)基因的功能和信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行探索，GO功能富集分析顯示，上述PPI核心基因可以通過(guò)影響核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、配體直接調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡過(guò)程、RNA聚合酶Ⅱ基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等實(shí)現(xiàn)抗直腸癌的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，半夏治療直腸癌的靶標(biāo)基因主要富集的通路涉及乙肝通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、小細(xì)胞肺癌通路、細(xì)胞凋亡通路、麻疹通路、HIV1感染通路、大腸癌通路、多種凋亡通路、EB病毒感染通路、TNF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鉑劑耐藥通路、IL-17信號(hào)通路、前列腺癌通路等，這些通路都與直腸癌的形成和發(fā)展密切相關(guān)，且與大腸癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等癌癥密切相關(guān)[25-27]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活p53信號(hào)通路及其下游信號(hào)通路，可以抑制腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到治療腫瘤的作用[28-29]。研究證實(shí)，宮頸癌、黑色素瘤、乳腺癌等中均存在IL-17的高表達(dá)，與促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過(guò)阻斷IL-17信號(hào)通路可以改變腫瘤微環(huán)境，從而減少腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展[30]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段對(duì)半夏的主要活性成分及靶點(diǎn)基因，以及與直腸癌作用通路的關(guān)系進(jìn)行分析，闡述了半夏抗直腸癌多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜作用機(jī)制，為更深入的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)，為研究其作用機(jī)制提供了新思路。