初生多肽相關(guān)復(fù)合物調(diào)控小麥禾谷鐮刀菌生長發(fā)育和致病性

王旭麗 *，謝鑫 b，劉敬 ，王國梁 c，邱德文 *

1. 引言

植物，尤其是農(nóng)作物不斷受到多種多樣的病原菌攻擊，造成各種病害的發(fā)生。植物病害不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，影響人類健康，也可導(dǎo)致生物多樣性破壞，致使人類生存環(huán)境惡化[1]。據(jù)估計(jì)，5種主要農(nóng)作物——玉米、小麥、大米、馬鈴薯和木薯——由于流行性真菌病害造成的損失足以養(yǎng)活全世界8.5%的人口[2]。面對持續(xù)反復(fù)的植物病害，有效保護(hù)和及時(shí)控制則顯得尤其重要。挖掘與病原菌生長發(fā)育和致病性相關(guān)的基因?qū)⒂兄谥贫ㄖ参锊『Ψ揽匦虏呗訹3]。

初生多肽相關(guān)復(fù)合物（NAC）是一種功能多樣的蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與蛋白質(zhì)的生物合成、組裝和運(yùn)輸，對于維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用[4]。在所有的真核生物中，NAC是由包含α-亞基和β-亞基的異源二聚體組成[5-7]。異源二聚體NAC與核糖體以1:1的比例相結(jié)合[8]，并以動(dòng)態(tài)且可逆的方式與核糖體和初生多肽相互作用[9]，從而實(shí)現(xiàn)類似分子伴侶的功能[10-12]。在釀酒酵母菌中，NAC協(xié)助新生蛋白質(zhì)的折疊和成熟，防止初生多肽錯(cuò)誤靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[13,14]，進(jìn)而使蛋白靶向線粒體[15]，并在功能上連接其他分子伴侶網(wǎng)絡(luò)，如Hsp70系統(tǒng)[16]。在秀麗隱桿線蟲中，NAC起著類似于其在酵母中的重要作用，可作為核糖體相關(guān)的分子伴侶來調(diào)節(jié)翻譯和協(xié)助初生多肽的折疊；同時(shí)，它也是一種重要且有益的蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)傳感器，不僅可以檢測蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激，還可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激的翻譯，從而為細(xì)胞提供調(diào)節(jié)反饋機(jī)制以維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[9]。NAC的這些獨(dú)特特性及其在細(xì)胞操作中的潛在作用，使它們成為從不同角度研究各種生物體的很好的對象。

在本研究中，我們鑒定了NAC在子囊真菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum，有性型：Gibberella zeae）中的作用，重點(diǎn)挖掘了其在該菌侵染小麥過程中的作用。禾谷鐮刀菌是一種極具破壞性的植物病原菌，可引起小麥和其他小粒谷物的赤霉?。‵HB）[17,18]。禾谷鐮刀菌的侵染不僅會(huì)直接造成田間谷物的產(chǎn)量損失，而且會(huì)在籽粒貯存過程中產(chǎn)生真菌毒素，對人體和動(dòng)物健康都有直接危害；因此，該真菌給全球的糧食安全造成了嚴(yán)重威脅[19-22]。通過致病相關(guān)基因研究將有助于深入認(rèn)識禾谷鐮刀菌與寄主植物之間的相互作用機(jī)理，從而為有效控制赤霉病提供新的研究策略。本研究采用基因敲除、酵母雙雜交、亞細(xì)胞定位和致病性檢測相結(jié)合的方法，明確了NACα在調(diào)控小麥赤霉病菌生長發(fā)育和致病過程中所發(fā)揮的重要作用。

2. 材料和方法

2.1. 真菌菌株和培養(yǎng)條件

利用禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H-1構(gòu)建基因缺失突變體。野生型菌株P(guān)H-1及其突變體培養(yǎng)在PDA和V8瓊脂培養(yǎng)基上。對培養(yǎng)于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗交替條件下的供試菌株進(jìn)行菌絲生長測定，每個(gè)菌株設(shè)置三個(gè)重復(fù)。在羧甲基纖維素（CMC）培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分生孢子產(chǎn)生[23]。所有供試菌株均以分生孢子懸浮液形式保存在20%甘油中，并置于-70 ℃條件下。

2.2. 生物信息學(xué)分析

禾谷鐮刀菌PH-1的基因組[24]是通過裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的NACα亞基（NP_596361，EGD2）氨基酸（aa）序列[25]，利用BLASTp進(jìn)行搜索并下載同源序列。用PH-1的NACα全長序列在GenBank中搜索并下載其他物種中同源序列（Supplementary data中的Table S1）。用Clustal X 2.0對同源氨基酸序列進(jìn)行比對分析[26]。用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件7.0版（MEGA7）構(gòu)建鄰接（neighbor-joining）進(jìn)化樹，并通過自舉檢驗(yàn)（bootstrapping，重復(fù)1000次）評估節(jié)點(diǎn)支持率[27]。

2.3. 缺失突變體和回復(fù)菌株的獲得

以禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株基因組DNA為模板構(gòu)建FgNACα基因敲除載體[28,29]。首先，擴(kuò)增FgNACα基因上游5′端824 bp同源臂片段，定向克隆至pUC19-G418R載體中獲得pUC19-A-G418；擴(kuò)增該基因下游5′端961 bp同源臂片段并定向克隆至pUC19-A-G418中，獲得pUC19-A-G418-B（Supplementary data中的Fig. S1）。然后，參照Yuan等[30]所述，采用聚乙二醇（PEG）-CaCl2法將HindIII酶切后線性化的載體轉(zhuǎn)化至PH-1原生質(zhì)體。采用單孢分離方法篩選獲得具有G418抗性的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步通過測序鑒定其基因型。

回復(fù)突變株的構(gòu)建，以禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含F(xiàn)gNACα基因編碼框[包括開放閱讀框（ORF）、啟動(dòng)子區(qū)和終止子區(qū)]在內(nèi)的片段，克隆到pMD18-T獲得互補(bǔ)載體pMD18-FgNACα，并進(jìn)行測序鑒定。分別用EcoRI酶切線性化回復(fù)載體pMD18-FgNACα和HindIII線性化的載體pUCATPH共同轉(zhuǎn)化到突變菌株原生質(zhì)體中獲得回復(fù)菌株。篩選對G418抗性敏感并可對潮霉素產(chǎn)生抗性的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步采用ORFα-F/ORFα-R引物對就以上獲得轉(zhuǎn)化子的基因型進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定（Supplementary data中的Table S2）。

2.4. 表型分析

供試菌株生長速率的測定，用打孔器在培養(yǎng)3 d的供試菌株菌落邊緣打取5 mm菌餅接種在PDA平板上，置于25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，每天測量菌落直徑，持續(xù)4 d。將培養(yǎng)2 d的4個(gè)5 mm大小的菌餅接種到100 mL液體CMC培養(yǎng)基中，置于25 ℃下培養(yǎng)5 d。以5000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，并用無菌蒸餾水清洗2次后收集分生孢子用于產(chǎn)孢量的分析。參照Hou等[31]所述的方法，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對分生孢子計(jì)數(shù)。在Olympus BH-2顯微鏡下觀察和測量分生孢子的形態(tài)和大小，每個(gè)供試菌株測量100個(gè)分生孢子。寬度為中間細(xì)胞寬度，長度為從頂端細(xì)胞至足細(xì)胞之間的長度。

2.5. 致病性測定

采用小麥品種銘賢169進(jìn)行麥穗和胚芽鞘接種試驗(yàn)。取10 μL在CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)了5 d的分生孢子懸浮液（4×105conidia·mL-1），將其注入到生長了35～42 d的小麥花序基部的第三個(gè)完整小穎。將接種過的小麥頂端套上小塑料袋，保濕培養(yǎng)48 h。接種后12 d，統(tǒng)計(jì)每株麥穗上的發(fā)病小穗數(shù)目，并參照已報(bào)道的病情指數(shù)公式計(jì)算發(fā)病率[32]。每個(gè)試驗(yàn)處理接種小麥穗數(shù)為9～10株，并且所有試驗(yàn)至少重復(fù)4次。按照Liu等[33]報(bào)道的方法接種小麥胚芽鞘，每個(gè)供試菌株接種50個(gè)胚芽鞘，置于生長箱中室溫培養(yǎng)。接種7 d后，測量棕色病斑的長度。

2.6. 酵母雙雜交檢測和亞細(xì)胞定位

采用Matchmaker GAL4雙雜交系統(tǒng)3（Clontech,USA）檢測FgNAC的兩個(gè)亞基之間的互作。將FgNACαORF克隆到pGADT7中獲得載體AD-FgNACα。從PH-1的cDNA中擴(kuò)增出FgNACβORF，并將其克隆到pGBKT7載體（BD-FgNACβ）用作酵母雙雜交試驗(yàn)的靶標(biāo)。測序鑒定后，采用堿離子法酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（MP Biomedicals, USA）將誘餌和靶標(biāo)載體共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109。在葡萄糖合成培養(yǎng)基（SD-Leu-Trp-His, SDLWH）上可觀察到Leu+和Trp+轉(zhuǎn)化子生長，然后按照Zhang等[34]的方法測量LacZ報(bào)告基因的表達(dá)。

為了研究FgNACα和FgNACβ在禾谷鐮刀菌中的亞細(xì)胞定位，分別擴(kuò)增FgNACα和FgNACβ的編碼區(qū)。基于pDL2載體構(gòu)建包含自身啟動(dòng)子的FgNACα和FgNACβ的C端融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的載體，并參照Sweigard等[35]描述的方法轉(zhuǎn)化禾谷鐮刀菌原生質(zhì)體。在Olympus BX61熒光顯微鏡下觀察所有供試樣品。

2.7. 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用單向方差分析方法（ANOVA）分析各處理之間的顯著性差異。當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異p值小于0.05時(shí)才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. 結(jié)果

3.1. FgNACα 和酵母 NACα 同源

通過裂殖酵母NACα亞基基因EGD2進(jìn)行BLASTp搜索，在禾谷鐮刀菌PH-1基因組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)NACα亞基基因（FGRAMPH1_01G10263），將該基因命名為FgNACα。FgNACα由1166個(gè)核苷酸組成，ORF為627 bp，編碼209個(gè)氨基酸。與EGD2類似，F(xiàn)gNACα分別在氨基和羧基端有一個(gè)保守的NAC結(jié)構(gòu)域（57個(gè)氨基酸）和一個(gè)泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域（40個(gè)氨基酸）[圖1（a）和（b）]。分析發(fā)現(xiàn)，基于NACα序列構(gòu)建的進(jìn)化樹與物種之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系完全一致[36]。FgNACα的氨基酸序列與稻瘟菌（XP_366584.1）同源序列具有70%氨基酸相似性，并與其他兩種真菌序列一起形成了一個(gè)可靠支持的亞分支（支持率79%）。所有真菌NACα序列形成一個(gè)高支持率的分支（99%）[圖1（c）]。這些結(jié)果表明FgNACα與其他真菌NACα是直系同源基因。

3.2. 禾谷鐮刀菌FgNACα 基因的敲除和回復(fù)

圖1. FgNACα同源基因的鑒定。（a）粟酒裂殖酵母（NP_596361, EGD2）和禾谷鐮刀菌（FGSG_08560.3, FgNACα）中NACα的氨基酸序列比較；（b）粟酒裂殖酵母和禾谷鐮刀菌中NACα的功能結(jié)構(gòu)域；（c）基于NACα氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。節(jié)點(diǎn)處數(shù)字表示自舉支持率。紅色標(biāo)記表示禾谷鐮刀菌的FgNACα。

以野生型PH-1作為陰性對照，通過G418抗性篩選和PCR鑒定，構(gòu)建FgNACα缺失突變體（fgnacα）。與引物對FgNACα-Ft1/Neo-F擴(kuò)增的2781 bp條帶相比，引物對ORFα-F/ORFα-R未檢測到FgNACα條帶（755 bp）[Fig. S1（b），泳道3]，說明FgNACα已被neo基因成功取代[Fig. S1（b），泳道1和2]。為了構(gòu)建FgNACα回復(fù)菌株fgnacα::FgNACα，克隆了包含啟動(dòng)子和終止子的2993 bp的FgNACα基因，連接至pUCATPH載體，經(jīng)HindⅢ線性化后轉(zhuǎn)化缺失突變菌株fgnacα原生質(zhì)體[Fig. S1（c）]，采用潮霉素和G418共同篩選轉(zhuǎn)化子并通過PCR鑒定。發(fā)現(xiàn)引物對ORFα-F/ORFα-R可在回復(fù)突變株中檢測到FgNACα帶（755 bp）[Fig. S1（d），泳道4]，但在缺失突變菌株fgnacα中沒有相關(guān)條帶[圖S1（d），泳道3]，表明FgNACα基因在缺失突變菌株fgnacα中成功恢復(fù)。

3.3. FgNACα 調(diào)控菌絲生長發(fā)育

測量PDA和V8培養(yǎng)基上的菌落直徑發(fā)現(xiàn)[圖2（a）]，與野生型菌株P(guān)H-1相比，缺失突變菌株fgnacα的菌絲生長顯著降低。缺失突變菌株fgnacα在培養(yǎng)期間生長緩慢，并且在PDA平板上接種的第3天，菌落直徑僅為野生型菌株菌落直徑的69% [圖2（b）]。另外，缺失突變菌株fgnacα還產(chǎn)生了少量含不規(guī)則菌落邊緣的氣生菌絲[圖2（a）]。在野生型菌株P(guān)H-1和回復(fù)菌株fgnacα::F-gNACα之間未觀察到表型差異（圖2）。同樣，在液體CMC培養(yǎng)基中，與整個(gè)培養(yǎng)過程中的野生型菌株和回復(fù)菌株相比，缺失突變菌株產(chǎn)生的菌絲體質(zhì)量更小，而野生型菌株和回復(fù)菌株的菌絲體生物量基本相當(dāng)[圖2（c）]。以上結(jié)果顯示FgNACα基因的缺失極大地限制了禾谷鐮刀菌菌絲的營養(yǎng)生長。

3.4. FgNACα 對分生孢子產(chǎn)量及形態(tài)的影響

為了研究FgNACα基因在生殖發(fā)育中的作用，我們比較了突變菌株和野生型菌株的分生孢子產(chǎn)量和孢子萌發(fā)情況。發(fā)現(xiàn)缺失突變菌株fgnacα與野生型菌株或回復(fù)菌株的分生孢子在形態(tài)上相比沒有明顯差異。而缺失突變菌株fgnacα的產(chǎn)孢量顯著減少（p< 0.05），僅為野生型菌株的40%左右和回復(fù)菌株的42%左右[圖3（a）]。此外，缺失突變菌株fgnacα的分生孢子萌發(fā)明顯延遲，與野生型和回復(fù)菌株相比，缺失突變菌株在CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h的萌發(fā)率僅為野生型菌株P(guān)H-1的32%[圖3（b）]。有趣的是，隨著時(shí)間的延長，缺失突變菌株的發(fā)芽率迅速上升，培養(yǎng)8 h時(shí)其萌發(fā)率約為野生型菌株的86%，培養(yǎng)12 h時(shí)其萌發(fā)率可達(dá)92%以上[圖3（b）]。而回復(fù)菌株的分生孢子發(fā)育與野生型菌株相似（圖4）。以上結(jié)果表明FgNACα基因可能參與了分生孢子形成過程的早期階段，且其功能可能受到其他基因的補(bǔ)償。

3.5. FgNACα 是禾谷鐮刀菌侵染小麥的關(guān)鍵基因

采用品種小麥銘賢169進(jìn)行致病性鑒定，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)小麥穗接種分生孢子12 d時(shí)，缺失突變菌株fgnacα的侵染率約為25%，而野生型菌株P(guān)H-1和回復(fù)菌株的侵染率超過47% [圖4（b）]。缺失突變菌株fgnacα與野生型菌株P(guān)H-1和回復(fù)菌株fgnacα::FgNACα相比致病力減弱[圖4（a）]。當(dāng)接種分生孢子至胚芽鞘時(shí)，獲得了相同結(jié)果[圖4（c）和（d）]，缺失突變菌株引起的病斑長度（約0.54 cm）明顯小于野生型菌株（1.92 cm）和回復(fù)菌株（1.88 cm）。這些結(jié)果表明FgNACα調(diào)控禾谷鐮刀菌對小麥的致病力。

3.6. FgNACα 和 FgNACβ 的互作及其亞細(xì)胞定位

圖2. FgNACα基因缺失影響菌絲生長。（a）野生型菌株P(guān)H-1、缺失突變菌株fgnacα和回復(fù)菌株fgnacα::FgNACα的菌絲生長狀態(tài)，培養(yǎng)條件為在PDA和V8培養(yǎng)基中，在25 ℃下培養(yǎng)3 d； （b）在PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃下培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d后的菌落直徑； （c）在液體CMC培養(yǎng)基中，在25 ℃下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的生物量。

據(jù)報(bào)道，NAC的α和β亞基可以相互作用，并通過形成異源二聚體發(fā)揮作用，以促進(jìn)線粒體蛋白前體在酵母胞質(zhì)中的積累[37]。為了檢測這兩個(gè)亞基的功能是否與它們在酵母中的功能相同，我們通過酵母雙雜交試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)（圖5），在酵母中FgNACα可以與FgNACβ相互作用[圖5（a）]。這意味著FgNACα與FgNACβ相關(guān)聯(lián)，并與FgNACβ在功能上相聯(lián)系。它們可能通過形成異源二聚體，進(jìn)而保護(hù)初生多肽不被蛋白質(zhì)水解。

圖3. 野生型菌株P(guān)H-1、缺失突變菌株fgnacα和回復(fù)菌株fgnacα::FgNACα在孢子數(shù)、形態(tài)和萌發(fā)率方面的差異。（a）PH-1、fgnacα和fgnacα::F-gNACα菌株的分生孢子產(chǎn)量； （b）CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h、8 h、12 h和24 h后的分生孢子萌發(fā)率。符號*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）；NS代表無顯著性差異。

圖4. FgNACα是禾谷鐮刀菌侵染小麥的關(guān)鍵基因。（a）、（b）麥穗接種實(shí)驗(yàn)，用野生型菌株P(guān)H-1、缺失突變菌株fgnacα和回復(fù)菌株fgnacα::F-gNACα的分生孢子接種小麥穗部。照片拍攝于接種后12 d。（c）、（d）FgNACα的缺失減弱了禾谷鐮刀菌對小麥胚芽鞘的致病性。箭頭指向表示PH-1、fgnacα和fgnacα::FgNACα侵染胚芽鞘上的棕色病變。照片拍攝于接種后7 d，符號*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。

為了進(jìn)一步研究FgNACα與FgNACβ的亞細(xì)胞定位，將GFP融合構(gòu)建于FgNACα與FgNACβ編碼區(qū)的羧基端，并將其轉(zhuǎn)化至野生型菌株P(guān)H-1原生質(zhì)體中。在熒光顯微鏡下，F(xiàn)gNACα-GFP和FgNACβ-GFP轉(zhuǎn)化菌株的分生孢子胞質(zhì)內(nèi)均可檢測到綠色信號[圖5（b）]。這些結(jié)果表明FgNACα與FgNACβ在禾谷鐮刀菌細(xì)胞中具有相同的定位，這可能為它們的物理相互作用提供了機(jī)會(huì)。

4. 討論

NAC是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與新合成多肽有相互作用的非核糖體因子[14]，其與信號識別分子一起共同促進(jìn)蛋白質(zhì)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保真性[38]。自NAC被發(fā)現(xiàn)20多年以來，其在酵母[15,39,40]、煙草[41]、線蟲[9]等多種模式生物中的潛在作用已被證實(shí)。研究表明NAC對于維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有不同的作用[4,42]。在大多數(shù)情況下，這種功能的多樣化常常伴隨著進(jìn)化的多樣性。然而，我們發(fā)現(xiàn)NACα在一級序列結(jié)構(gòu)和功能域方面的進(jìn)化都是高度保守的（圖1）。從動(dòng)物到植物再到真菌，NACα的氨基酸序列均非常相似，都包含一個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域和一個(gè)UBA結(jié)構(gòu)域[圖1（a）和（b）]。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，基于NACα序列構(gòu)建的進(jìn)化樹與物種演化關(guān)系高度一致[圖1（c）]。本研究發(fā)現(xiàn)NAC的α和β亞基形成異源二聚體（圖5），在其他物種中也存在這種現(xiàn)象[5,6]，因此我們猜測NACβ在進(jìn)化方面也是保守的。而這種進(jìn)化與功能的不一致性，可能因?yàn)镹AC是蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵因素，并且在功能上與其他代謝網(wǎng)絡(luò)（如Hsp70系統(tǒng)）相連[16]。這種功能的多樣性和進(jìn)化的保守性，意味著本文對禾谷鐮刀菌的研究結(jié)果也許可被推及至其他植物病原菌，反之亦然，因此以NAC為研究目標(biāo)的病害治理方法具有跨病害的適用性。

盡管關(guān)于NACα在模式生物中的生物學(xué)功能已有廣泛研究，但其在非模式生物中的作用仍鮮為人知。本研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌的NACα亞基基因不僅參與該菌的營養(yǎng)生長過程，而且正調(diào)控其致病性。在其他植物病原菌中，有報(bào)道稱核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）中的NACα對其致病性具有負(fù)調(diào)控作用[43]。NACα對病原菌致病性的調(diào)控差異可能與這兩種病原菌不同的生活方式有關(guān)。禾谷鐮刀菌是半活體營養(yǎng)型真菌，而核盤菌是死體營養(yǎng)型真菌。在動(dòng)物中，NACα也參與動(dòng)物對病原菌的先天免疫反應(yīng)過程。當(dāng)螃蟹感染鰻弧菌（Vibrio anguillarum）時(shí)，NACα的表達(dá)量顯著上調(diào)[44]。同樣地，當(dāng)魚受到愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）的攻擊時(shí)，NACα在魚組織中的表達(dá)上調(diào)，并且NACα的過表達(dá)增強(qiáng)了抗性基因的表達(dá)[45]。在植物中的研究表明，沉默本氏煙（Nicotiana benthamiana）的NACα基因可以抑制雀麥花葉病毒在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移[41]。此外，接種青枯菌（Ralstonia solanacearum）后，番茄抗性品種中的NACα蛋白含量高于番茄感病品種[46]。很顯然，確定NACα在病原菌發(fā)病機(jī)制中的作用，就必須研究NACα在小麥或寄主植物中的功能以及其在病原菌-宿主系統(tǒng)中的分子相互作用關(guān)系。

對真菌病原物而言，入侵植物細(xì)胞的能力是成功定植和感染植物的前提，而維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力是發(fā)揮細(xì)胞功能以生存和繁衍的必要條件。而對植物病原菌中維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的真菌調(diào)節(jié)因子的研究仍然很少。本文的研究對象是FgNACα，它是一種在進(jìn)化過程中高度保守的維持蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，其參與調(diào)控真菌的生長發(fā)育和致病性。此外，我們的研究結(jié)果表明，F(xiàn)gNACα的功能可能是通過與FgNACβ形成異源二聚體來實(shí)現(xiàn)的（圖5）。然而植物的發(fā)病機(jī)制是通過病原菌與宿主之間的分子相互作用以及病原菌調(diào)節(jié)因子與宿主調(diào)節(jié)因子之間的分子相互作用來實(shí)現(xiàn)的。所以闡明NAC在病原菌-宿主相互作用系統(tǒng)中發(fā)揮不同功能的分子機(jī)制將是非常有意義的。

圖5. FgNACα與FgNACβ相互作用。（a）酵母雙雜交驗(yàn)證FgNACα與FgNACβ互作。FgNACα與GAL4的激活域（AD）融合，F(xiàn)gNACβ與GAL4的結(jié)合域（BD）融合。AH109酵母的轉(zhuǎn)化子分別被稀釋10倍、100倍和1000倍，然后在不含亮氨酸和色氨酸的葡萄糖培養(yǎng)基（SD-LW）和SDLWH平板上生長。（b）FgNACα和FgNACβ在禾谷鐮刀菌中的亞細(xì)胞定位。檢測表達(dá)FgNACα-GFP或FgNACβ-GFP融合載體的分生孢子。在熒光顯微鏡下觀察所有樣品。

5. 結(jié)論

有效的植物保護(hù)技術(shù)通常源于對病原菌的可靠了解。這些基礎(chǔ)知識無疑將有助于人們對發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生新的見解，并提出新的植物保護(hù)策略。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)植物病原真菌禾谷鐮刀菌的NACα與來自酵母和其他真菌物種的同源對應(yīng)物表現(xiàn)出高度的結(jié)構(gòu)和功能相似性。缺失NACα的禾谷鐮刀菌突變體可以存活，但其在營養(yǎng)生長、分生孢子產(chǎn)生和對小麥的致病性方面均存在明顯缺陷。缺失NACα帶來的功能性后果可能源于NAC在蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的重要作用，正如在酵母和其他模型生物中所發(fā)現(xiàn)的那樣。從植物保護(hù)的角度來看，NAC在開發(fā)具有破壞性的植物病害FHB的創(chuàng)新控制方法方面的作用值得被認(rèn)可。

致謝

這項(xiàng)工作得到了國家自然科學(xué)基金（31471737、31671984、31801691）和貴州省留學(xué)歸國人員高級計(jì)劃（[2018]02）的支持。

Compliance with ethics guidelines

Xuli Wang, Xin Xie, Jin Liu, Guo-Liang Wang, and Dewen Qiu declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.07.025.