甘油誘導(dǎo)的鼠李糖脂增強(qiáng)伯克霍爾德菌屬C3 中二苯并噻吩的生物降解

Camila A. Ortega Ramirez, Abraham Kwan, Qing X. Li

1. 引言

土壤和水是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)必不可少的自然資源。在高度城市化的地區(qū)，人類活動(dòng)造成的污染損害了農(nóng)田和河流的完整性，導(dǎo)致土壤功能下降并引發(fā)食品安全問題。北非和南亞等地區(qū)可用土地的利用率已超過90% [1]。在中國，污水灌溉造成了土壤污染[2]。土壤生物修復(fù)可以幫助恢復(fù)土地以進(jìn)行重復(fù)利用和農(nóng)作物生產(chǎn)。生物修復(fù)是利用微生物的生命代謝活動(dòng)去清除環(huán)境中的污染物[3,4]。多環(huán)芳烴（PAH）是一類典型的人類活動(dòng)污染物[2]。二苯并噻吩（DBT）是一種重要的含硫PAH[5]，常被用作評估多環(huán)芳烴土壤污染[5]的模型化合物。DBT是一種疏水性化合物，水溶解度為7.9 μmol·L-1，辛醇-水系數(shù)為4.44 [6]。DBT的親脂性使其既能夠在環(huán)境中富集，又能通過食物鏈進(jìn)行生物蓄積，從而引發(fā)食品安全和生態(tài)毒理風(fēng)險(xiǎn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，DBT會(huì)明顯損害斑馬魚胚胎的心臟功能，并且高濃度的DBT含量與胚胎形態(tài)異常和死亡[6]相關(guān)。一項(xiàng)研究表明，DBT及其代謝產(chǎn)物在T47D人乳腺癌細(xì)胞[8]中充當(dāng)雌激素類化合物。沉積物和城市地區(qū)中DBT的高檢測頻率、人體接觸的潛在風(fēng)險(xiǎn)和健康威脅使其成為一種令人擔(dān)憂的化學(xué)品，因此需要對DBT進(jìn)行環(huán)境管理[5,8]。

疏水性污染物（如DBT）的生物修復(fù)經(jīng)常受到微生物豐度低和化學(xué)生物利用度差的限制，導(dǎo)致生物降解動(dòng)力學(xué)作用降低[9]。除了分解代謝酶[10-12]外，在污染土壤中有意增加能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物[13,14]，也是一種提高化學(xué)溶解和生物利用度的方法[15,16]。細(xì)菌產(chǎn)生生物表面活性劑和分解代謝酶的現(xiàn)象[17-20]表明，微生物通過進(jìn)化適應(yīng)來克服底物利用性低的問題。

伯克霍爾德菌C3是從PAH污染區(qū)分離出來的PAH降解菌[21]。它含有負(fù)責(zé)降解PAH [如菲（phenanthrene）]的雙加氧酶基因[22,23]。本研究旨在探討甘油作為共底物刺激C3菌株降解DBT。我們的初步研究表明，與其他測試底物（如葡萄糖）不同，甘油可以增強(qiáng)DBT的生物降解作用。在添加甘油的培養(yǎng)基過程中，觀察到明顯的DBT增溶、泡沫形成和C3對DBT的早期降解，而在僅有DBT的培養(yǎng)基中未觀察到此現(xiàn)象。這種差異是由一種表面活性劑的分泌造成的。甘油很容易進(jìn)入β-氧化和從頭合成脂肪酸（FAS II）的脂質(zhì)代謝途徑，從而影響鼠李糖脂（RL）生物表面活性劑和聚羥基烷酸（PHA）的產(chǎn)生[24,25]。關(guān)于伯克霍爾德菌屬（Burkholderiasp.）產(chǎn)生的鼠李糖脂（RL）的報(bào)道很少。據(jù)我們所知，這是關(guān)于甘油誘導(dǎo)的RL生物合成與DBT生物降解直接關(guān)聯(lián)的首次報(bào)道。我們的研究表明，甘油生物刺激可提高疏水性污染物的生物利用度，從而實(shí)現(xiàn)對環(huán)境中DBT的有效降解。因此，本研究中涉及的研究技術(shù)可能適用于疏水性污染物（如農(nóng)藥）的生物修復(fù)。

2. 材料和方法

2.1. C3 的培養(yǎng)和二苯并噻吩的生物降解

在450 ℃下，將實(shí)驗(yàn)試管高溫烘烤3 h。將溶解在丙酮中的DBT倒入試管中，然后用氮?dú)猓∟2）將丙酮完全蒸發(fā)。接下來，往試管中加入5 mL的基本培養(yǎng)基（MM）[26]和適量的50%甘油的水溶液。DBT的終濃度為0.54 mmol·L-1[100 ppm (1 ppm = 10-6)]；甘油的終濃度為0、0.05 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1、50 mmol·L-1、200 mmol·L-1或500 mmol·L-1。 在LB富集培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)的C3細(xì)胞，用基本培養(yǎng)基（MM）清洗3次，把基本培養(yǎng)基的光密度調(diào)整至OD600= 0.5時(shí)的水平，在0.05 OD600的濃度下，在每支試管中接種0.5 mL的C3細(xì)胞。同時(shí)，還準(zhǔn)備了含甘油但不含DBT的培養(yǎng)物。在RL生物合成抑制實(shí)驗(yàn)中，2-溴己酸（HEX）和2-溴辛酸（OC）的終濃度為2 mmol·L-1。在30 ℃的旋轉(zhuǎn)振蕩器中以200 r·min-1的速度培育培養(yǎng)物。高壓滅菌的C3細(xì)胞為對照組。

2.2. 二苯并噻吩的提取和分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[27]的方法提取和分析DBT。實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)為：在用氯化氫（HCl）將培養(yǎng)物酸化至pH值為2～3后，用乙酸乙酯提取DBT 3次。然后在配有Aqua C18色譜柱（150 mm×4.60 mm，粒徑為5 μm；Phenomenex, Inc., USA）的Agilent 1100系列高效液相色譜儀（HPLC）上分析DBT，檢測波長為245 nm。流動(dòng)相為60%的乙腈水溶液（ACN）。

2.3. 數(shù)據(jù)計(jì)算

根據(jù)平均值條的標(biāo)準(zhǔn)誤差（平均值代表3個(gè)或6個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的差異）繪制時(shí)間點(diǎn)。降解曲線用一級動(dòng)力學(xué)方程C=C0×e-kt擬合，其中，k是DBT生物降解速率常數(shù)，C是時(shí)間t時(shí)測得的濃度，C0是初始濃度（表1）。采用公式t1/2= ln2/k計(jì)算DBT的半衰期（t1/2）。采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，如Tukey真實(shí)顯著性差異檢驗(yàn)法（HSD）測試、最小顯著差異法（LSD）測試和Bonferroni法測試。

2.4. 蛋白質(zhì)的提取

蛋白質(zhì)的提取方法以研究報(bào)告[28]為基礎(chǔ)并稍加改動(dòng)：實(shí)驗(yàn)第2天從培養(yǎng)物中收集C3細(xì)胞，用過濾和消毒的蒸餾水清洗3次，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。將9 mL的9 mol·L-1尿素溶液與1 mL的10×蛋白酶抑制劑溶液混合，制備裂解緩沖液。用Sigma快速蛋白酶抑制劑片劑（Sigma-Aldrich, USA）制備蛋白酶抑制劑溶液。用5850g的離心力完全除去培養(yǎng)基后，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在700 μL的裂解緩沖液中。將該細(xì)胞懸浮液添加到300 μL的裂解緩沖液并將混合液置于螺紋樣品瓶中，該螺紋樣品瓶（比例為2∶3）中預(yù)先裝有直徑為0.5 mm玻璃珠（BioSpec Products, USA）。先后在小型珠磨式組織研磨器（BioSpec Products, USA）和冰上以最大速度循環(huán)進(jìn)行6次珠磨，各持續(xù)1 min，破壞細(xì)胞膜。在離心力20 820g下離心15 min去除細(xì)胞碎片后，用Amicon Ultra-0.5 mL離心過濾器（3 K cutoff; Millipore, USA）過濾培養(yǎng)液的上清液以濃縮蛋白質(zhì)。然后用500 μL mQ水漂洗過濾器。

2.5. 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析用蛋白質(zhì)樣品的制備

將36 μg的蛋白質(zhì)上樣到12%的SDS-PAGE。用含考馬斯藍(lán)的凝膠給蛋白質(zhì)條帶染色，以便于觀察。每個(gè)凝膠泳道容積被分級為約1 mm3，并用25 mmol·L-1碳酸氫銨（NH4HCO3）或50%乙腈（ACN）清洗，直至碎片變得清晰可見。先用100% ACN對凝膠碎片脫水，然后在56 ℃下進(jìn)行30 min的二硫蘇糖醇還原反應(yīng)，然后在室溫下進(jìn)行20 min的碘乙酰胺烷基化反應(yīng)。在37 ℃下用胰蛋白酶/Lys-C混合液（Mass-Spec Grade, Promega,USA）消化凝膠里的蛋白質(zhì)，時(shí)長16～18 h。將蛋白質(zhì)消化物脫鹽并用Pierce C18 tips (Thermo Scientific, USA)濃縮，然后在Bruker nanoLC-amaZon速度離子阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)上進(jìn)行分析。在C18分析柱（0.1 mm×150 mm,3 μm, 200 ?, Bruker, USA）上用含0.1%甲酸的乙腈溶液（濃度配比范圍：5%～65%）梯度洗脫80 min（2 min的運(yùn)行延遲）后分離出肽。洗脫90 min后，將流動(dòng)相更改為含有0.1%甲酸的95% ACN溶液，并保持原樣10 min，下一步用含有0.1%甲酸的5% ACN溶液柱平衡20 min。流速為800 nL·min-1。質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置為：毛細(xì)管電壓為1600 V，毛細(xì)管溫度為149.5 ℃。在質(zhì)荷比（m/z）400～3000的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，然后對10種最豐富的離子進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析，儀器誤差為0.5 Da。動(dòng)態(tài)排斥設(shè)置為重復(fù)同一前體離子兩次，然后排斥0.8 min。

表1 生物降解速率常數(shù)的增強(qiáng)及DBT的半衰期取決于甘油濃度

2.6. 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)庫檢索

使用數(shù)據(jù)分析軟件（Bruker, USA）將原始文件（文件類型為BAF）轉(zhuǎn)換為mascot 通用格式（.mgf格式）。峰值提取算法為頂點(diǎn)算法。絕對強(qiáng)度閾值為100。

標(biāo)準(zhǔn)型和同工型蛋白質(zhì)序列（492個(gè)條目）數(shù)據(jù)庫為FASTA格式，并從UniProt數(shù)據(jù)庫下載（2016年4月4日上午9:35）。該數(shù)據(jù)庫由固定搜索詞——伯克霍爾德菌（Burkholderia）（UniProt分類法：32008）和其他關(guān)鍵詞——不同蛋白質(zhì)名稱組成。使用MyriMatch搜索引擎進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索[29]。配置如下：分析儀器類型為離子阱，前體質(zhì)量為auto，酶為胰蛋白酶/P（允許鑒定胰蛋白酶/Lys-C混合消化物），平均前體耐受性為1.5m/z，片段耐受性為0.5m/z，單體前體耐受性為10 ppm。改性方法為：氨甲酰甲基（固定）和蛋氨酸氧化（可變）。

2.7. 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

用IdPicker軟件對每次處理中鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行光譜計(jì)數(shù)。處理方法如下：A. 0.54 mmol·L-1DBT；B.50 mmol·L-1甘油；C. 50 mmol·L-1甘油和0.54 mmol·L-1DBT；D. 50 mmol·L-1甘油、0.54 mmol·L-1DBT和2 mmol·L-1OC。將肽與其MS/MS匹配的過濾器如下：最大錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）為1%，每個(gè)肽和每個(gè)匹配項(xiàng)至少有一個(gè)光譜。為了使肽與蛋白質(zhì)相匹配，實(shí)驗(yàn)至少允許有兩個(gè)不同的肽和光譜以及兩個(gè)最小的附加肽[30,31]。根據(jù)參考文獻(xiàn)[32]中的假設(shè)對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即MS/MS強(qiáng)度等于1且不考慮肽的長度。應(yīng)用lg(normalizedcount+1)，并將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)與原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。用DEseq [33]進(jìn)行方差分析（ANOVA,p<0.05），找出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)豐度變化。每種蛋白質(zhì)的甘油與DBT相互作用的p值和lg Fold change (FC)值如表2所示。lg FC表示甘油與DBT相互作用的效應(yīng)量。在有甘油和DBT相互作用的處理（即處理C和D）中，lg FC值增大表明甘油和DBT的相互作用對該處理中蛋白質(zhì)的豐度有積極影響。

2.8. 鼠李糖脂的提取和定量

根據(jù)參考文獻(xiàn)[34]的方法提取鼠李糖脂。方法總結(jié)為：實(shí)驗(yàn)第2天，在離心力5850g下離心10 min后，用過濾器（孔徑為0.2 μm）過濾分離細(xì)胞。用乙酸乙酯（ethyl acetate）萃取培養(yǎng)基3次。在溫和的氮?dú)鈿饬飨禄旌喜⒏稍锸罄钐侵腿∥?，收集剩余物，重新懸浮?.5 mL的甲醇中。在基本培養(yǎng)基（MM）中，對 溶 于5 mmol·L-1或50 mmol·L-1甘 油 中 的RL標(biāo) 準(zhǔn) 液（50 μg·mL-1）進(jìn)行相同的操作。用orcinol測試[35][含0.19% orcinol（m/V）的53%硫酸（V/V）溶液]對鼠李糖脂進(jìn)行定量檢測。收集和干燥250 μL樣本試樣，將其重新懸浮于250 μL 水中并稀釋定容。向100 μL 鼠李糖脂萃取物溶液或不同濃度的鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)液中加入900 μL苔黑素溶液試樣，然后將混合液在80 ℃下溫育30 min，在421 nm處測量其吸光值。在0～500 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)繪制鼠李糖脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)參考文獻(xiàn)[34]的方法，用配備有Aqua C18色譜柱（150 mm×4.60 mm，粒徑為5 μm；Phenomenex Inc., USA）的Agilent 1100系列的高效液相色譜儀（HPLC; Agilent Technologies, USA）分離剩余的250 μL甲醇重懸浮液。分別在時(shí)間段（F1）4～5 min處和時(shí)間段（F2）5～6 min處收集兩個(gè)鼠李糖脂餾分，然后放置在45 ℃條件下至完全干燥。將餾分重新懸浮于10 μL 10%的ACN/水混合溶液中，用Pierce C18 tips (Thermo Scientific, USA)將餾分脫鹽。對制造商的方案進(jìn)行了如下修改：不使用三氟乙酸。將F1和F2樣本用C18脫鹽10次，用5%的ACN清洗5次，用10 μL 70%的ACN洗脫。在45 ℃下將樣本充分干燥，然后重新懸浮于2 μL 50%的ACN中，該溶液中含有40 mg·mL-1的2,5-二羥基苯甲酸（DHB）基質(zhì)。將1 μL基質(zhì)點(diǎn)樣到目標(biāo)板上并風(fēng)干，然后點(diǎn)樣1 μL樣品/基質(zhì)混合物。

表2 實(shí)驗(yàn)第2天處理后，經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)伯克霍爾德菌屬C3中鼠李糖脂的生物合成作用

2.9. 鼠李糖脂的鑒定

按照公開的程序步驟，用基體輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間（MALDI/TOF）ultraflexIII質(zhì)譜儀（Bruker,USA）的正反射子模式操作鑒定出鼠李糖脂的同系物[36]。用聚合度（DP）鏈校準(zhǔn)該儀器：麥芽三糖水合物（DP3, MW: 504.44 g·mol-1）、麥芽四糖（DP4, MW:666.57 g·mol-1）、麥芽五糖（DP5, MW: 828.71 g·mol-1）和麥芽六糖（DP6, MW: 990.85 g·mol-1）[37]。從每個(gè)聚合度鏈中提取500 μmol·L-1試樣溶于mQ水中。依次將5 μL 聚合度鏈混合到20 μL的DHB基質(zhì)中，混合液的最終濃度為62.5 μmol·L-1。在MALDI目標(biāo)板上觀察2 μL的混合物試樣，風(fēng)干試樣。質(zhì)譜儀m/z的范圍是300～1200，激光束脈動(dòng)頻率為每次激光發(fā)射50次脈動(dòng)，激光強(qiáng)度為38%～50%。離子質(zhì)量被限制在300 Da以下。使用Flexi Analysis軟件和Compass Isotope Pattern模擬軟件（Bruker,USA）進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)參考報(bào)告[38]的方法創(chuàng)建insilico數(shù)據(jù)庫，為鼠李糖脂分配RL峰，質(zhì)量誤差為0.5 Da。

使用Agilent 6520A液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LC-Q-TOF-MS）（Agilent Technologies, Canada）對樣品進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析。在Luna C18色譜柱（100 mm×2.0 mm，粒徑為3 μm；Phenomenex Com Inc., USA）上，緩沖溶液從5 mmol·L-15% ACN甲酸銨緩沖水溶液（aqueous ammonium formate buffer）變換到95% ACN甲酸銨緩沖水溶液進(jìn)行梯度洗脫，從而分離出20 μL的鼠李糖脂樣品，分離后靜置15 min。流動(dòng)相的流速為0.3 mL·min-1。每次運(yùn)行儀器之前先平衡色譜柱10 min。電噴霧電離界面設(shè)置為負(fù)極。毛細(xì)管電壓為4000 V。碎裂器電壓和分離器電壓分別為180 V和80 V。當(dāng)系統(tǒng)處于MS/MS模式時(shí)，干燥和霧化氣體設(shè)定為氮?dú)猓鲎矚怏w設(shè)定為氦氣。氣體溫度設(shè)為350 ℃。干燥氣流量為10 L·min-1。霧化器壓力為25 psi。在m/z為50～1700范圍內(nèi)收集全掃描數(shù)據(jù)。MS/MS模式下的碰撞能量為20 eV。

3. 結(jié)果與討論

3.1. 甘油的生物刺激作用增強(qiáng)了DBT 的生物降解，促進(jìn)了Burkholderia sp. C3 菌株的生長

這項(xiàng)研究采用一種生物刺激策略，研究甘油對Burkholderiasp.C3菌株的DBT生物降解能力的影響。DBT和甘油的共底物實(shí)驗(yàn)既沒有顯示出碳分解代謝抑制現(xiàn)象，也沒有拮抗作用，這在其他共底物混合物中已被報(bào)道[16,39,40]。如圖1所示，結(jié)果表明，用甘油進(jìn)行生物刺激可促進(jìn)C3細(xì)胞的生長，同時(shí)增強(qiáng)DBT的生物降解。實(shí)驗(yàn)表明，DBT的生物降解的增強(qiáng)程度取決于甘油與DBT的摩爾比和培育時(shí)間。當(dāng)用0.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1、50 mmol·L-1和200 mmol·L-1的甘油刺激培養(yǎng)物時(shí)，觀察到顯著差異（Tukey HSD; LSD; Bonferroni;p<0.001）。在這些濃度下，培育1天后，甘油將DBT的生物降解率提高了25%～30%。培育7 天后，在甘油（50 mmol·L-1）與DBT摩爾比為92.6∶1的培養(yǎng)物中，菌株C3 100%地降解了0.54 mmol·L-1（100 ppm）的DBT。該甘油的最佳濃度用于蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。在此濃度下，DBT半衰期從27.5天降低至1.5天，降至最低，DBT降解速率常數(shù)顯示出18倍的增長（表1）。如表1所示，在高壓滅菌細(xì)菌的對照培養(yǎng)物中觀察到的降解可忽略不計(jì)。與添加50 mmol·L-1甘油時(shí)的DBT生物降解動(dòng)力學(xué)相似，在含有0.5 mmol·L-1的培養(yǎng)物中，C3菌株在第10天降解了0.54 mmol·L-1DBT的92%。但是，在此甘油濃度下，C3菌株的生長保持在0.05 OD600，這表明生物量的增加不是DBT生物降解增強(qiáng)的唯一原因，DBT生物降解增強(qiáng)涉及其他分子機(jī)制。統(tǒng)計(jì)分析表明，第7天到第10天之間DBT生物降解沒有顯著差異（Tukey HSD; LSD; Bonferroni;p<0.05）。因此，在本研究條件下建議生物降解7天。

作為唯一的碳源，DBT不支持菌株C3細(xì)胞的生長。培育10天后，OD600維持在0.05，這與初始接種量相等（圖1）。在含單一碳源的液體培養(yǎng)物中PAH的生物降解取決于細(xì)菌菌株、PAH的結(jié)構(gòu)和濃度。例如，在第7天，C3菌株降解了40 ppm DBT的94% [22]。我們的結(jié)果表明，在第7天，C3降解了100 ppm DBT的11%～12%。在此濃度下，DBT對細(xì)菌沒有明顯的益處，甚至觀察到生物降解效率降低。這一發(fā)現(xiàn)得到了以下事實(shí)的支持：與單用甘油相比，甘油-DBT混合物中的C3細(xì)胞生長受到抑制。例如，當(dāng)0.54 mmol·L-1的DBT與甘油組成的混合物的濃度介于50～500 mmol·L-1之間，在培養(yǎng)1天后開始，C3細(xì)胞生長減少，相對于單獨(dú)的甘油，其生長增加到0.3 OD600。在較低濃度（0.05～5 mmol·L-1）的甘油中，DBT的生長不受抑制。50～500 mmol·L-1的甘油抑制C3細(xì)胞生長可能與DBT、DBT的代謝產(chǎn)物或兩者的毒性有關(guān)。據(jù)報(bào)道，PAH的疏水性和致癌性會(huì)影響其毒性[16,41,42]。

3.2. RL 生物合成途徑在Burkholderia sp. C3 菌株中被激活

甘油是假單胞菌產(chǎn)生RL的良好碳源[38]。它可以被代謝吸收到影響PHA顆粒形成和RL產(chǎn)生的脂質(zhì)的途徑中[24,38,43,44]。表2列出了在四種處理中檢測到的酶的相對豐度，即：A. 0.54 mmol·L-1DBT； B. 50 mmol·L-1甘 油；C. 50 mmol·L-1甘 油 和0.54 mmol·L-1DBT；D.50 mmol·L-1甘油、0.54 mmol·L-1DBT和2 mmol·L-1OC以及l(fā)g FC和p值。這些酶負(fù)責(zé)RL的生物合成，如圖2所示。RL的生物合成需要分別由FAS II [45,46]和（或）β-氧化[24]產(chǎn)生的R-3-羥基癸?；?ACP或-CoA脂質(zhì)前體，以及dTDP-L-鼠李糖糖前體[43]。一旦脂質(zhì)和糖的前體產(chǎn)生，RhlABC介導(dǎo)單-或雙-RL的形成。在四種處理中檢測到了與dTDP-L-鼠李糖生物合成有關(guān)的合成代謝酶AlgC和RmlBCD（圖2、表2）。RmlD催化dTDP-4-酮-6-脫氧-L-甘露糖合成dTDP-鼠李糖。在不同處理間RmlD的相對蛋白豐度變化顯著（p<0.05），并且lg FC上調(diào)。lg FC代表甘油與DBT相互作用項(xiàng)的影響。它的上調(diào)表明這種相互作用對含有該項(xiàng)的處理有積極的作用。催化該途徑中前一步的酶RmlC也被上調(diào)。RmlD和RmlC的相對豐度表明RL生物合成抑制劑2-溴辛酸（OC）不會(huì)抑制RL糖前體的合成。

圖1. Burkholderia sp. C3菌株的DBT生物降解動(dòng)力學(xué)及其在0.54 mmol·L-1 DBT和不同甘油補(bǔ)充量（0、0.05 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1、50 mmol·L-1、200 mmol·L-1和500 mmol·L-1）下的10天培養(yǎng)期中的生長。

在四種處理中檢測到來自FAS II和（或）α-氧化途徑的酶（圖2、表2）。FabG是通過FAS II途徑催化R-3-羥基癸酰ACP合成的最后一步的酶[46]。在所有處理中，F(xiàn)abG的相對豐度均大于1，表明已檢測到該蛋白質(zhì)。但是，p值高于0.05，這意味著它們的相對豐度沒有顯著差異（表2）。在處理C中，由FabF催化的先前步驟被上調(diào)。處理C中β-氧化酶FadB和FadE含量豐富（表2）。結(jié)果表明，在培育的第2天，F(xiàn)AS II和β-氧化途徑的后期階段在C3中是活躍的。

RhlA產(chǎn)生3-羥基鏈烷酸（HAA），然后RhlB將其用于單鼠李糖脂的生物合成[47]。鑒定到RhlA，lg FC顯示上調(diào)。同時(shí)鑒定到鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶RhlB和RhlC（表 2）。RhlB和RhlC分別參與單鼠李糖脂[48,49]和二鼠李糖脂[50]的直接形成。表2中鑒定的蛋白質(zhì)表明，甘油誘導(dǎo)了C3細(xì)胞中合成RL生物表面活性劑的脂質(zhì)前體。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AS II和β-氧化途徑都參與了脂質(zhì)前體的合成。但是，尚不確定哪條途徑占主導(dǎo)地位，因?yàn)檫@些途徑在細(xì)胞中還有其他作用，如細(xì)胞增殖。

圖2. Burkholderia sp. C3菌株中與RL生物合成有關(guān)的蛋白質(zhì)的鑒定。粗體蛋白在甘油與DBT相互作用項(xiàng)（lg FC）中顯示出上調(diào)。FadB：烯脂酰輔酶A水合酶/ 3-羥酰輔酶A脫氫酶； FadE：酰基輔酶A脫氫酶；FabF：β-氧代?；?ACP合酶2；ACP：?；d體蛋白；FabG：3-氧代?；?ACP-還原酶；RhlA：HAA合酶；HAA：3-羥基鏈烷酸；RhlB：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶1；RhlC：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶2；AlgC：磷酸葡萄糖變位酶/磷酸甘露糖變位酶；RmlB：dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶；RmlC：dTDP-4-脫水海洛糖-3,5-表異構(gòu)酶；RmlD：dTDP-4-脫水海藻糖還原酶。

3.3. Burkholderia sp. C3 菌株中增強(qiáng)的DBT 生物降解受RL 生物合成及其抑制作用的影響

DBT是疏水性的[6]，其生物利用度是生物降解的首要條件[15]。當(dāng)補(bǔ)充甘油時(shí)，在培養(yǎng)物中觀察到DBT增溶和泡沫形成。這些觀察結(jié)果表明了有表面活性劑的分泌。我們的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，RL生物表面活性劑的生物合成途徑在C3中是活躍的。因此，用草皮酚測定法研究了RL與甘油誘導(dǎo)的DBT生物降解增強(qiáng)的相關(guān)性[51]。

Gutierrez等[25]表明，溴鏈烷酸對于RhlA的抑制作用會(huì)抑制假單胞菌物種中RL和PHA的產(chǎn)生，并且這種抑制作用取決于所用的溴鏈烷酸。文獻(xiàn)[24]中也描述了RL和PHA的抑制作用。因此，使用2-溴鏈烷酸（HEX或OC）來探討RL在菌株C3降解DBT中的作用。如果RL在DBT生物降解中起作用，則HEX和OC應(yīng)通過抑制RL的生物合成來降低DBT的生物降解。與單獨(dú)的DBT培養(yǎng)相比，在甘油/DBT混合物中培養(yǎng)菌株C3時(shí)，可以確定RL分泌的增加。由不同濃度的甘油誘導(dǎo)的RL生物合成和分泌[圖3（a）]與降解的DBT量密切相關(guān)[圖3（b）]，HEX和OC抑制RL的生物合成也是如此。結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果相符；RL生物合成發(fā)生在C3菌株中，并與其生物降解能力密切相關(guān)。

3.4. RL 同源物由Burkholderia sp. C3 菌株分泌

包含Rha-Rha-C10-C10和Rha-C10-C10同系物混合物的RL標(biāo)準(zhǔn)品用于鑒定實(shí)驗(yàn)樣品中的RL。在4～6 min之間洗脫RL同系物（圖4）。實(shí)驗(yàn)樣品的HPLC色譜圖與RL標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖非常吻合（數(shù)據(jù)未顯示）。用0.5 mmol·L-1DBT和50 mmol·L-1或0 mmol·L-1甘油從實(shí)驗(yàn)樣品中提取兩個(gè)組分F1和F2，還收集了用2 mmol·L-1HEX或OC抑制劑處理過的培養(yǎng)物的餾分。添加了50 mmol·L-1甘油的培養(yǎng)物，提取物的HPLC色譜峰強(qiáng)度比0 mmol·L-1甘油HPLC色譜峰強(qiáng)度高約10倍。甘油引起RL產(chǎn)量的增加。值得注意的是，在OC色譜圖上出現(xiàn)了多個(gè)峰[圖4（c）、（f）]。

RL同系物的峰最強(qiáng)。在50 mmol·L-1的甘油樣品中，C3分泌了同源物Rha-C10-C10（M1 + Na+）、Rha-Rha-C10-C10（M2 + Na+）、鈉（M3 + Na+）或鉀（M3+ K+）加合物離子形式的Rha-Rha-C10-C12和Rha-Rha-C12-C12（M4 + Na+）。在0 mmol·L-1甘油樣品和含HEX或OC抑制劑的樣品（50 mmol·L-1或0 mmol·L-1甘油中）中鑒定出單鼠李糖脂同源物Rha-C12-C12（數(shù)據(jù)未顯示）。用MS/MS確認(rèn)峰M1和M2。Rha-C10-C10的質(zhì)譜圖如圖4（h）所示。觀察到C10酰基鏈和鼠李糖糖片段（Rha）的丟失。結(jié)論是甘油通過RL介導(dǎo)的機(jī)制支持C3細(xì)胞生長并促進(jìn)DBT的生物降解。

我們的研究結(jié)果表明，利用甘油可以有效地生物降解被污染土壤中的持久性有機(jī)污染物（包括有機(jī)氯農(nóng)藥和PAH），因此可用于恢復(fù)土地功能，這一功能也使其可用于農(nóng)業(yè)用途。這種生物刺激策略可以與合適的微生物聯(lián)合體的生物增強(qiáng)相結(jié)合應(yīng)用。我們的研究表明，甘油與PAH降解劑和RL生產(chǎn)者的混合物可能會(huì)在細(xì)菌群體中引發(fā)較高的響應(yīng)。為了正確評估生物修復(fù)位點(diǎn)，需要對細(xì)菌種群和細(xì)胞呼吸進(jìn)行初步分析，以及隨時(shí)間的推移監(jiān)測PAH的生物降解情況。

圖3. 第2天分泌的RL量（a）與第1天在含有2 mmol·L-1的2-溴己酸（HEX）或2 mmol·L-1的2-溴辛酸（OC）和不同的甘油濃度（0、0.05 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1、50 mmol·L-1和200 mmol·L-1）的情況下被由無抑制劑培育的Burkholderia sp. C3菌株降解的DBT量（b）之間的關(guān)聯(lián)。

圖4. Burkholderia sp. C3菌株分泌的RL的HPLC色譜圖。其中C3菌株分別用0.54 mmol·L-1 DBT和50 mmol·L-1甘油（a）、2 mmol·L-1 HEX（b）或2 mmol·L-1 OC（c）、0.54 mmol·L-1 DBT（d）、2 mmol·L-1 HEX（e）或2 mmol·L-1的OC（f）培養(yǎng)。（g）從HPLC色譜圖a、餾分2（F2）鑒定出的4個(gè)RL同系物（M1、M2、M3和M4）的MALDI-TOF-MS；（h）Rha-C10-C10 (M1)的LC-Q-TOF-MS2。

4. 結(jié)論

RL的兩親性表明了RL生產(chǎn)者和PAH降解劑具有多種功能。一些功能與疏水化學(xué)增溶、化學(xué)吸收和生物同化有關(guān)。我們的研究表明，培育1天后，用甘油進(jìn)行生物刺激，DBT的生物降解率增加了30%。這種增強(qiáng)與Burkholderiasp. C3和細(xì)菌的生長增加了鼠李糖脂的生物合成有關(guān)。此外，我們報(bào)道了2-溴鏈烷酸在Burkholderia中抑制RL生物合成的用途。據(jù)我們所知，這是關(guān)于甘油補(bǔ)充與DBT生物降解和RL生物合成相關(guān)的第一份報(bào)告。結(jié)果表明本文所述的生物刺激策略具有潛在的實(shí)用性，可提高生物修復(fù)效率并促進(jìn)此類過程。

Acknowledgements

This work was supported in part by Grant N00014-12-1-0496 from the Office of Naval Research and a subcontract with the Western Center for Agricultural Health and Safety(NIOSH grant 2U54OH007550). The authors thank Dr.Margaret R. Baker for her assistance with MALDI/TOF.

Compliance with ethics guidelines

Camila A. Ortega Ramirez, Abraham Kwan, and Qing X. Li declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Nomenclature

ACN acetonitrile

CoA coenzyme A

FabZ 3-hydroxy-ACP-dehydratase

FDR false discovery rate

HEX 2-bromohexanoic acid

HPLC high-performance liquid chromatograph

HSD honestly significant difference

LSD least significant difference

DHB dihydroxybenzoic acid

DP degree of polymerization

OC 2-bromooctanoic acid

DBT dibenzothiophene

FAS IIde novofatty acid synthesis

FadB enoyl-CoA hydratase/3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase

FadE acyl-CoA dehydrogenase

FabF β-oxoacyl-ACP synthase 2

ACP acyl carrier protein

FabG 3-oxoacyl-ACP-reductase

RhlA HAA synthase

HAA 3-hydroxy alkanoic acid

RhlB rhamnosyltransferase 1

RhlC rhamnosyltransferase 2

AlgC phosphoglucomutase/phosphomannomutase

RmlB dTDP-glucose 4,6-dehydratase

RmlC dTDP-4-dehydrorhamnose-3,5-epimerase

RmlD dTDP-4-dehydrorhamnose reductase

MALDI/TOF matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight

LC-Q-TOF-MS liquid chromatograph-quadrupole time-offlight mass spectrometer

MM minimal medium

MS mass spectrometry

PAH polycyclic aromatic hydrocarbon

PHA polyhydroxyalkanoic acid

RL rhamnolipid