含硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)的新型芳香酰胺類衍生物的設(shè)計(jì)、合成及生物活性

華學(xué)文*，劉南南，周沙，張蕾蕾，殷昊，王桂清，范志金，馬翼

1. 引言

近年來，土壤線蟲危害日趨嚴(yán)重，特別是根結(jié)線蟲危害在一些地區(qū)有暴發(fā)的態(tài)勢[1,2]。目前，市場上廣泛應(yīng)用的土壤線蟲化學(xué)防治藥劑主要是噻唑磷（fosthiazate）和阿維菌素（avermectin）B2a（圖1）。傳統(tǒng)的高毒或劇毒殺線蟲劑，如氨基甲酸酯類涕滅威（carbamates aldicarb）、克百威（carbofuran）、殺線威（oxamyl），有機(jī)磷酸酯類克線磷（fenamiphos）、硫線磷（cadusafos）、豐索磷（fensulfothion）等，在中國已被禁止或者限制使用。早期的熏蒸劑，如溴甲烷等也因破壞臭氧層而被逐漸淘汰。

新型殺線蟲劑的研究對土壤線蟲防治十分重要。目前，殺線蟲活性組分的開發(fā)主要依靠篩選現(xiàn)有殺蟲劑、除草劑或殺菌劑對線蟲的防治效果，這導(dǎo)致了新型殺線蟲劑開發(fā)緩慢以及線蟲防治藥劑嚴(yán)重不足。近期，一些農(nóng)用化學(xué)品企業(yè)報(bào)道了多種新型殺線蟲劑活性成分（圖 2），其中，氟吡菌酰胺（fluopyram）是由德國拜耳公司成功開發(fā)的新型酰胺類殺線蟲劑，同時(shí)也被用作廣譜殺菌劑[3-6]，其作用機(jī)制為抑制線粒體呼吸電子傳遞鏈上的琥珀酸脫氫酶（SDH）[7]。隨后，其他具有殺線蟲活性的酰胺類結(jié)構(gòu)被相繼報(bào)道（圖3）[8-14]。

圖1. 噻唑磷和阿維菌素B2a的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2. 近期成功開發(fā)的殺線蟲劑活性成分。

圖3. 近期報(bào)道的殺線蟲的酰胺類化合物結(jié)構(gòu)。Het：取代的芳香雜環(huán)。

植物病害嚴(yán)重威脅作物生產(chǎn)，而殺菌劑的使用在過去、現(xiàn)在以及未來都是防治植物病害的有效途徑[15]。在國際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）列出的超過224種殺菌劑種類中，琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類殺菌劑在新產(chǎn)品開發(fā)及商品化方面是增長最快的一類殺菌劑[16]。自第一種SDHI殺菌劑萎銹靈于1966年被成功開發(fā)以來，目前已有23種商品化的SDHI殺菌劑獲批用于防治植物病原真菌，如核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、絲核菌（Rhizoctonia solani）、灰霉菌（Botrytis cinerea）等，其中氟吡菌酰胺具有一個(gè)獨(dú)特的酰胺橋結(jié)構(gòu)[17,18]。

鑒于上述已報(bào)道的大多數(shù)新型殺線蟲結(jié)構(gòu)具有雜環(huán)、硫醚、砜和酰胺亞結(jié)構(gòu)[19,20]，同時(shí)考慮到氟吡菌酰胺合成制備過程中涉及高溫脫羧或者高壓還原[21]，本文通過將硫醚、砜和各種芳香環(huán)引入氟吡菌酰胺的分子骨架中，設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)系列的目標(biāo)化合物（圖4）。目標(biāo)化合物I-1 ～ I-12、II-1 ～ II-12以及中間體4a的合成路線如圖5所示，該合成路線具有合成方便、后處理簡單、收率高等優(yōu)點(diǎn)。

2. 材料與方法

2.1. 試劑與設(shè)備

所有反應(yīng)試劑均為分析純。目標(biāo)化合物的熔點(diǎn)通過X-4顯微鏡熔點(diǎn)儀（河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）測定。1H和13C核磁共振（NMR）譜圖通過Bruker AV-400光譜儀（400 MHz）測定，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，以百萬分率（ppm）表示化學(xué)位移。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Varian 7.0 T FTMS高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）測定。柱層析純化所用硅膠為200～300目。

2.2. 目標(biāo)化合物的合成

中間體3和4a以及目標(biāo)化合物I-1 ～ I-12、II-1 ～I(xiàn)I-12通過已報(bào)道的合成方法制備[8,22,23]。相應(yīng)的合成路線及結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)見Supplementary data。

圖4. 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)思路。Ar、Ar′：取代的芳香環(huán)。

圖5. 目標(biāo)化合物的合成路線。（a）目標(biāo)化合物的有機(jī)合成路線；（b）不同取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。DMF：N,N-二甲基甲酰胺；mCPBA：間氯過氧化苯甲酸；RT：室溫；Et：乙基。

2.3. 生物活性篩選

目標(biāo)化合物對南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）的殺線蟲活性測試參照文獻(xiàn)[24,25]的方法。用稀釋后的次氯酸鈉（NaOCl）溶液從受感染的番茄（Solanumlycopersicum）根莖中提取南方根結(jié)線蟲的卵，充分沖洗后，將卵鋪展到孔徑為30 μm的尼龍濾網(wǎng)上，將濾網(wǎng)放置到含水的培養(yǎng)皿中，在25 ℃溫度下培養(yǎng)。每天收集二齡幼蟲（J2）并直接將其用于生物活性測試。通過將目標(biāo)化合物溶解在二甲基亞砜中，并用0.1%的吐溫-80水溶液稀釋，制備待測溶液。將待測溶液加入到24孔組織培養(yǎng)板中，每孔二齡線蟲的濃度大約為每毫升水含100條二齡線蟲，然后蓋上24孔組織培養(yǎng)板蓋，于（25 ± 1）℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)三次，24 h后用體視顯微鏡觀察線蟲死亡率。如果線蟲蟲體靜止不動(dòng)（如蟲體筆直），即使轉(zhuǎn)入到清水中12 h后仍然靜止不動(dòng)，則認(rèn)為線蟲死亡。

此外，鑒于對照藥氟吡菌酰胺的殺菌活性，通過菌絲生長抑制法[26]測定了目標(biāo)化合物的離體抑菌率。測試的常見植物病原真菌為玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani,RS）、小麥赤霉病菌（Gibberella zeae, GZ）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola, PP）、桃褐斑病菌（Cercospora circumscissa, CS）、梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana, AK）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea,BC）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici, CC）以及茄褐紋病菌（Phomopsis vexans, PV）。

2.4. 分子對接

采用SYBYL 6.9軟件中的Surflex-Dock方法[27]研究具有優(yōu)異殺菌活性的目標(biāo)化合物I-9與SDH的分子對接模型。文獻(xiàn)[7]報(bào)道氟吡菌酰胺為SDHI，特異性結(jié)合到線粒體SDH的泛醌結(jié)合位點(diǎn)（Q-位點(diǎn)）。根據(jù)泛醌在大腸桿菌（E. coli）SDH的Q-位點(diǎn)的結(jié)合位置（PDB ID:1NEK）[28]，將化合物I-9和氟吡菌酰胺對接到大腸桿菌SDH的Q-位點(diǎn)。受體和配體分子的準(zhǔn)備工作參照標(biāo)準(zhǔn)方法完成。

3. 結(jié)果與討論

3.1. 化學(xué)合成

關(guān)鍵的中間體3和目標(biāo)化合物I-1 ～ I-12、II-1 ～I(xiàn)I-12按照Supplementary data中的步驟合成制備。首先，酰氯中間體2通過芳香甲酸酰化制備，然后與2-氯乙胺鹽酸鹽反應(yīng)得到酰胺中間體3。芳香硫酚4通過購買市售產(chǎn)品或者實(shí)驗(yàn)室制備得到，其中，3-氯-5-三氟甲基吡啶-2-硫酚（4a）通過2,3-二氯-5-三氟甲基吡啶和硫氫化鈉反應(yīng)制備。最后，N-(2-氯乙基)芳香酰胺中間體3和硫酚4反應(yīng)得到目標(biāo)化合物I-1 ～ I-12，用間氯過氧化苯甲酸（mCPBA）進(jìn)一步氧化得到II-1 ～ II-12。然而，在過量的mCPBA作用下，目標(biāo)化合物I-4、I-8和I-12中噻唑環(huán)上的硫原子進(jìn)一步被氧化為亞砜結(jié)構(gòu)，得到目標(biāo)化合物II-4、II-8和II-12。由于硫醚亞結(jié)構(gòu)的引入，使得目標(biāo)化合物的合成路線相較對照藥氟吡菌酰胺的更加方便、快捷，同時(shí)避免了高溫、高壓等反應(yīng)條件。目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)通過1H NMR、13C NMR和HRMS進(jìn)行表征，部分結(jié)構(gòu)參數(shù)通過化合物I-3的單晶結(jié)構(gòu)（CCDC No. 1830647，圖6）揭示。

3.2. 生物活性

目標(biāo)化合物對南方根結(jié)線蟲的殺線蟲活性見表1，以氟吡菌酰胺為陽性對照。由表1數(shù)據(jù)得出，與對照藥氟吡菌酰胺相比，大多數(shù)目標(biāo)化合物在200 μg·mL-1濃度下顯示了優(yōu)異的殺線蟲活性，但化合物I-2除外。當(dāng)測試濃度降低為100 μg·mL-1時(shí)，目標(biāo)化合物的殺線蟲活性大大降低，然而化合物I-11和II-6仍然顯示出了較好的殺線蟲活性，線蟲死亡率分別為75%和70%，以上結(jié)果將為探索潛在的殺線蟲劑先導(dǎo)化合物提供一定的理論指導(dǎo)。此外，針對含硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物而言，兩者之間的殺線蟲活性無明顯差異。

圖6. 化合物I-3的單晶結(jié)構(gòu)。

鑒于對照藥氟吡菌酰胺的殺菌活性，測試了目標(biāo)化合物的抑菌率，結(jié)果見表2。由表2可知，與氟吡菌酰胺相比，大多數(shù)目標(biāo)化合物顯示出了相對較弱的殺菌活性，然而化合物I-9除外，其抑菌率幾乎與對照藥相當(dāng)。同時(shí)，與殺線蟲結(jié)果類似，針對含硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物而言，兩者之間的殺菌活性無明顯差異?；谝陨辖Y(jié)果，氟吡菌酰胺結(jié)構(gòu)中硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)的引入和芳香雜環(huán)的替換對目標(biāo)化合物的殺菌活性影響較大，這可能是由于酰胺橋長度的改變影響了化合物與靶標(biāo)酶結(jié)合的優(yōu)勢構(gòu)象，這些結(jié)果對探索和開發(fā)潛在的殺菌劑先導(dǎo)化合物具有重要的指導(dǎo)意義。

表1 目標(biāo)化合物對南方根結(jié)線蟲的殺線蟲活性

表2 目標(biāo)化合物在100 μg·mL-1濃度下的殺菌活性

為了進(jìn)一步評估化合物I-9的殺菌活性，測試了其與氟吡菌酰胺對測試植物病原真菌的EC50值，結(jié)果見表 3。由表中數(shù)據(jù)得出，化合物I-9和氟吡菌酰胺對小麥赤霉病菌的抑制活性均較弱，并且化合物I-9的抑制活性相對弱于對照藥氟吡菌酰胺。然而，總體上，化合物I-9對黃瓜灰霉病菌、辣椒炭疽病菌以及茄褐紋病菌顯示出明顯優(yōu)于其他測試病原真菌的殺菌活性。

3.3. 分子對接模擬

文獻(xiàn)[7]報(bào)道殺菌和殺線蟲劑氟吡菌酰胺的作用機(jī)制為抑制線粒體呼吸電子傳遞鏈上的復(fù)合體II，即SDH或琥珀酸輔酶Q還原酶（SQR）。雖然目前氟吡菌酰胺與靶標(biāo)酶SDH之間的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)尚未在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（RSCB PDB）中被報(bào)道，但文獻(xiàn)[28]指出作用于SDH的酰胺類殺菌劑特異性地結(jié)合到復(fù)合體II的輔酶Q位點(diǎn)。因此，研究配體與靶標(biāo)酶之間的結(jié)合模式將為揭示離體殺菌結(jié)果提供一定的理論指導(dǎo)。

運(yùn)用SYBYL軟件中的Surflex-Dock模塊模擬化合物I-9、氟吡菌酰胺和大腸桿菌SDH（PDB碼：1NEK）之間的相互作用，結(jié)果見圖7。由圖中數(shù)據(jù)得出，氟吡菌酰胺結(jié)構(gòu)中酰胺鍵上的羰基氧和鄰三氟甲基基團(tuán)上的氟原子的存在有助于其與靶標(biāo)酶輔酶Q位點(diǎn)的氨基酸殘基B/TRP-164、D/TYR-83和C/ARG-31形成氫鍵相互作用，這有利于改善殺菌活性。同時(shí)，三氟甲基基團(tuán)與酰胺鍵上的羰基氧處于酰胺橋的同側(cè)，這有助于二者共同與氨基酸殘基B/TRP 164形成氫鍵相互作用[圖7（a）]。

當(dāng)將3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑引入酰胺橋后，酰胺鍵鄰位二氟甲基基團(tuán)上氟原子的存在有助于其與氨基酸殘基之間形成氫鍵相互作用，這與氟吡菌酰胺的結(jié)合模式近乎一致?？紤]到氟吡菌酰胺和目標(biāo)化合物I-9的優(yōu)異殺菌活性及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合分子對接結(jié)果，可以得出酰胺鍵及其鄰位含氟基團(tuán)的存在對化合物的殺菌活性至關(guān)重要。另一方面，在芳香硫醚部分引入不同的芳香環(huán)以及改變酰胺橋的長度對目標(biāo)化合物的生物活性有重要影響。

表3 化合物I-9和氟吡菌酰胺的EC50值

圖7. （a）氟吡菌酰胺與大腸桿菌SDH（PDB碼：1NEK）的結(jié)合模型；（b）化合物I-9與大腸桿菌SDH的結(jié)合模型；（c）氟吡菌酰胺與化合物I-9的疊合構(gòu)象；（d）化合物I-9與大腸桿菌SDH的對接口袋。TYR、TRP、ARG、HIS、SER是氨基酸殘基。

4. 結(jié)論

本文通過將硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)引入氟吡菌酰胺母體骨架中，設(shè)計(jì)合成了24種結(jié)構(gòu)新穎的目標(biāo)化合物。經(jīng)生物活性測試發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾對化合物的殺線蟲和殺菌活性存在不同程度的影響。雖然硫醚和砜亞結(jié)構(gòu)的引入使得目標(biāo)化合物的合成路線得到優(yōu)化，但是生物活性受到重要影響。通過各種芳香雜環(huán)的替換發(fā)現(xiàn)了具有良好殺線蟲活性的化合物I-11、II-6以及具有優(yōu)異殺菌活性的化合物I-9，結(jié)合分子對接模擬，該結(jié)果將為下一步的分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

致謝

本文研究工作由山東省自然科學(xué)基金（ZR2017 BC053）、聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（318051625）資助。

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Xuewen Hua, Nannan Liu, Sha Zhou, Leilei Zhang,Hao Yin, Guiqing Wang, Zhijin Fan, and Yi Ma declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.09.011.