注射大鼠腦神經(jīng)膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞
——一種創(chuàng)新的體外方法研究擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)天然態(tài)離子通道的影響

John Clark *, Steve Symington

1. 從除蟲(chóng)菊到擬除蟲(chóng)菊酯——綠色化學(xué)的開(kāi)端

1.1. 化學(xué)過(guò)程

除蟲(chóng)菊是從菊科植物灰菊頭中提取出的6種天然親脂性除蟲(chóng)菊酯的混合物，可以說(shuō)是最成功、最有效的天然植物源性殺蟲(chóng)劑。除蟲(chóng)菊的殺蟲(chóng)特性自中世紀(jì)以來(lái)就已為人所知，并被廣泛用于保護(hù)人們免受跳蚤、虱子和蜱蟲(chóng)的侵害，這些寄生蟲(chóng)傳播了各種人類(lèi)疾病，已造成數(shù)百萬(wàn)人死亡。然而，由于天然的除蟲(chóng)菊酯在空氣、光線、水和土壤中會(huì)被迅速分解為無(wú)殺蟲(chóng)活性的產(chǎn)物，因此其在很大程度上局限于室內(nèi)或個(gè)人使用。在20世紀(jì)60～70年代，人們采取了一種系統(tǒng)的方法來(lái)改變天然除蟲(chóng)菊酯的光不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，同時(shí)保留了其快速且有效的殺蟲(chóng)作用和對(duì)哺乳動(dòng)物低毒性等特性。最重要的是用鹵素（如溴、氯和氟）取代天然酯酸基化的乙烯基部分的甲基，以及用光穩(wěn)定性醇（如3-苯氧芐醇）取代天然醇部分。這些研究促使20多種合成除蟲(chóng)菊酯（擬除蟲(chóng)菊酯）被合成和商業(yè)化，并被廣泛而大量地用于昆蟲(chóng)控制的各個(gè)方面，包括農(nóng)業(yè)、病媒控制、家庭和寵物殺蟲(chóng)劑配制等，幾乎人人都有可能接觸到[1]。最成功的兩種擬除蟲(chóng)菊酯是I型擬除蟲(chóng)菊酯，即氯菊酯（3-苯氧芐醇的亞甲基碳上沒(méi)有α-氰基）和II型擬除蟲(chóng)菊酯，即溴氰菊酯（有α-氰基）。

1.2. 作用位置和模式

天然除蟲(chóng)菊酯、合成擬除蟲(chóng)菊酯和p,p′-二氯二苯三氯乙烷（DDT）在神經(jīng)組織中有一個(gè)共同的主要作用靶點(diǎn)：電壓門(mén)控鈉離子通道（VSSC）。以上這些殺蟲(chóng)劑都會(huì)導(dǎo)致VSSC失活速度減慢和失活時(shí)間延長(zhǎng)，最終導(dǎo)致鈉離子內(nèi)流增加和膜去極化。對(duì)于I型擬除蟲(chóng)菊酯，如氯菊酯，去極化導(dǎo)致后電位去極化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)放電和中毒性震顫綜合征（T綜合征）。在II型擬除蟲(chóng)菊酯（如溴氰菊酯）的情況下，失活被大大延長(zhǎng)，導(dǎo)致大量膜去極化，并造成伴有中毒性唾液分泌綜合征（CS綜合征）的舞蹈手足徐動(dòng)癥。

1.3. 《食品質(zhì)量保護(hù)法》和美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局/風(fēng)險(xiǎn)杯分析

1996年，美國(guó)國(guó)會(huì)通過(guò)了《食品質(zhì)量保護(hù)法》（FQPA），并指示美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（USEPA）從總暴露量和累積風(fēng)險(xiǎn)方面重新評(píng)估農(nóng)藥的允許量。如FQPA所述，應(yīng)增加與具有共同作用機(jī)制的殺蟲(chóng)劑相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，如果總風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)設(shè)定的量（風(fēng)險(xiǎn)杯），此類(lèi)農(nóng)藥將被禁止使用。由于擬除蟲(chóng)菊酯在VSSC中具有共同的作用機(jī)制，并被廣泛和集中地使用，因此USEPA開(kāi)始了一項(xiàng)數(shù)據(jù)審查。2010年，USEPA通知注冊(cè)人，在與人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估關(guān)聯(lián)更密切的低劑量條件下，測(cè)試未能解決青少年與成人對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯敏感性可能存在年齡相關(guān)差異的問(wèn)題。作為回應(yīng)，擬除蟲(chóng)菊酯人類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估促進(jìn)委員會(huì)（CAPHRA）于2011年成立，其代表擬除蟲(chóng)菊酯和除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑登記人的利益，并解決以下問(wèn)題：兒童（也就是剛學(xué)會(huì)吃飯的幼兒）是否比成人對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的神經(jīng)毒性更敏感?

為了解決這一問(wèn)題，CAPHRA開(kāi)發(fā)了一個(gè)研究項(xiàng)目，系統(tǒng)地檢查與擬除蟲(chóng)菊酯神經(jīng)毒性相關(guān)的毒物動(dòng)力學(xué)（即吸收、分配、新陳代謝、分泌）和毒效動(dòng)力學(xué)（受體-配體相互作用建立效力和效能）的各個(gè)方面，并區(qū)分新生大鼠所描述的敏感性是否與嬰兒和兒童有關(guān)。2011年，CAPHRA接受了神經(jīng)膜小組的提議，該小組是由馬薩諸塞大學(xué)阿姆赫斯特分校、薩烏瑞吉納大學(xué)和精密生物測(cè)定公司的研究人員組成的一個(gè)聯(lián)合會(huì)，旨在對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的潛在年齡相關(guān)的毒效動(dòng)力學(xué)差異進(jìn)行體內(nèi)/體外評(píng)估。以下是通過(guò)改進(jìn)基于注射大鼠腦神經(jīng)膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞和高通量電生理技術(shù)的微移植試驗(yàn)來(lái)解決這一問(wèn)題的創(chuàng)新體外方法的發(fā)展綜述。

2. 需要解決的問(wèn)題和合理的解決方案

2.1. 問(wèn)題——沒(méi)有所謂的VSSC

為了研究擬除蟲(chóng)菊酯等神經(jīng)毒性殺蟲(chóng)劑對(duì)離子通道的影響，人們采用了多種電生理學(xué)方法，包括體外細(xì)胞記錄、全細(xì)胞膜片鉗以及通過(guò)向非洲爪蟾卵母細(xì)胞中注射互補(bǔ)RNA（cRNA）來(lái)實(shí)現(xiàn)克隆通道的異源表達(dá)[2]。電生理學(xué)允許快速收集與離子通道門(mén)控過(guò)程速度相匹配的數(shù)據(jù)，是直接測(cè)定神經(jīng)毒物對(duì)通道開(kāi)啟和關(guān)閉過(guò)程動(dòng)力學(xué)所起作用的首選方法。然而，很多最常用于檢測(cè)天然通道活性的制劑是非神經(jīng)性[3]和（或）非哺乳動(dòng)物性的[4,5]。此外，電壓敏感離子通道，包括VSSC，是由多種亞基型經(jīng)過(guò)選擇性剪接、RNA編輯及包括糖基化、甲基化和磷酸化在內(nèi)的翻譯后修飾等步驟，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)組裝而成的。這種組裝過(guò)程的分歧在于，并沒(méi)有所謂的VSSC，正相反，存在著大量不同的通道，具有獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)特性。因此，人們通常并不知道組織中表達(dá)的通道亞型的實(shí)際組成，也不知道它們的表達(dá)如何隨時(shí)間或位置而變化。因此，要想逐個(gè)地測(cè)定擬除蟲(chóng)菊酯等神經(jīng)毒物對(duì)個(gè)體VSSC的影響，即便有可能成功，也是一項(xiàng)困難的任務(wù)。由于許多異源表達(dá)的通道沒(méi)有經(jīng)過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和翻譯后修飾，其使用也會(huì)導(dǎo)致其他問(wèn)題。

2.2. 一種解決方案——將神經(jīng)膜片段微移植到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中

另一種方法是將完整生化系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)與電生理學(xué)的靈敏度和快速獲取數(shù)據(jù)的特點(diǎn)相結(jié)合，使上述方案的許多問(wèn)題最小化?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[6-13]構(gòu)建了一種方法，將神經(jīng)膜片段（即神經(jīng)膜）注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中。這種使用許多不同生物的神經(jīng)片段的方法確實(shí)有效，而且能直接測(cè)量流經(jīng)完整離子通道的離子流，這些離子通道在標(biāo)準(zhǔn)的二電極電壓鉗（TEVC）電生理學(xué)方法下，通過(guò)適當(dāng)?shù)膩喕鶚?gòu)造和翻譯后修飾，嵌入其內(nèi)源性脂質(zhì)中。然而，該技術(shù)的主要問(wèn)題之一是卵母細(xì)胞與神經(jīng)膜片段的結(jié)合具有變異性[9,14]。

3. 我們的方法——將神經(jīng)膜注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞

3.1. 方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

微移植技術(shù)是將含有天然脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的大鼠腦神經(jīng)膜片段植入非洲爪蟾卵母細(xì)胞的質(zhì)膜中，使其發(fā)揮作用。本方法的優(yōu)點(diǎn)包括：①表達(dá)的蛋白質(zhì)以?xún)?nèi)源性狀態(tài)存在，并被其天然脂質(zhì)所包圍，與大鼠腦內(nèi)的狀態(tài)相似；②有許多神經(jīng)靶點(diǎn)包括電壓敏感離子通道，可供研究；③注射后1～2 h可快速研究離子電流；④僅注射幾納克的組織就足以測(cè)量離子電流；⑤新鮮和冷凍的腦組織皆可使用；⑥該程序可以研究不同物種、年齡和大腦區(qū)域之間的差異；⑦可通過(guò)電子方式或藥理學(xué)的方法分離特定的離子電流；⑧使用標(biāo)準(zhǔn)的電生理學(xué)方法可快速采集數(shù)據(jù)，并且適用于高通量系統(tǒng)（如Robocyte2?）[15]。這種方法的缺點(diǎn)有：①在許多組織和物種中存在非特異性蛋白；②由于多個(gè)靶蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生復(fù)雜的離子電流；③神經(jīng)片段結(jié)合的水平和方向可變[9]。

3.2. 將神經(jīng)膜注入卵母細(xì)胞的初試驗(yàn)

借助自動(dòng)免疫印跡和TEVC電生理學(xué)技術(shù)，我們開(kāi)始將幼年與成年大鼠腦組織片段微移植入非洲爪蟾光滑的卵母細(xì)胞中，來(lái)探究其年齡相關(guān)的表達(dá)模式、功能性差異以及對(duì)I型擬除蟲(chóng)菊酯（氯菊酯）和II型擬除蟲(chóng)菊酯（溴氰菊酯）的敏感性等方面的差異[16-18]。

經(jīng)過(guò)這些初步研究，我們證實(shí)：成年大鼠腦神經(jīng)膜微移植入卵母細(xì)胞的質(zhì)膜，在天然態(tài)下這些細(xì)胞包含了在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的全部9種VSSC亞型，在膜去極化時(shí)誘發(fā)一種復(fù)雜的外向離子電流，其中一部分對(duì)河豚毒素（TTX，一種特殊的VSSC阻滯劑）很敏感，當(dāng)緩沖液中的鈉離子被非滲透的膽堿離子取代時(shí)，該離子流也隨之消失[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，去極化時(shí)所見(jiàn)的外向電流主要是由鈣激活氯電流引起的，該電流可通過(guò)使用尼氟滅酸（NFA）進(jìn)行實(shí)質(zhì)性阻斷，顯示出TTX敏感的內(nèi)向電流（圖1）。

這種TTX敏感內(nèi)向電流在DDT [一種神經(jīng)毒性殺蟲(chóng)劑，也作用于VSSC；但非神經(jīng)毒性代謝物二氯二苯二氯乙烯（DDE，一種非神經(jīng)毒性代謝物）除外]、氯菊酯和溴氰菊酯的協(xié)同作用下以濃度依賴(lài)性的方式增長(zhǎng)，用脈沖去極化后曲線下面積（AUC）來(lái)測(cè)量[17,18]。盡管TTX敏感的AUC值同使用Hill方程生成的與擬除蟲(chóng)菊酯相關(guān)的S形濃度-響應(yīng)曲線相當(dāng)吻合，但由標(biāo)準(zhǔn)誤差條判斷的變異很大，降低了該方法在監(jiān)管問(wèn)題上的有效性（圖2、圖3）。

4. 提升精密度與分析性能

圖1. 在NFA存在時(shí)，被微移植入非洲爪蟾卵母細(xì)胞的PND90大鼠腦神經(jīng)膜組織中，由殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)出TTX敏感內(nèi)向電流。TTX敏感內(nèi)向電流（右端）是由處理軌跡和TTX不敏感軌跡（左端）之間的差異產(chǎn)生的。

圖2. 存在NFA（一種由Ca2+激活的氯離子通道阻滯劑）時(shí)，增加擬除蟲(chóng)菊酯濃度對(duì)PND90大鼠腦神經(jīng)膜微移植到非洲爪蟾光滑的卵母細(xì)胞引起的去極化、TTX敏感內(nèi)向電流的影響。（a）電生理的TTX敏感電流顯示了氯菊酯濃度增加的影響；（b）濃度依賴(lài)響應(yīng)曲線（CDRC）顯示了氯氰菊酯對(duì)AUC電流軌跡的影響，其表現(xiàn)為超出對(duì)照的百分比；（c）10-6 mol·L-1的氯菊酯對(duì)失活τ值的影響數(shù)值（τ0.5，使50%的去極化VSSC失活所用的時(shí)間）的影響；（d）說(shuō)明溴氰菊酯濃度增加影響的電生理TTX敏感電流軌跡；（e）CDRC顯示了溴氰菊酯對(duì)AUC值的影響，AUC值表示為超出控制的百分比；（f）10-6 mol·L-1的溴氰菊酯對(duì)失活τ值（τ0.5）的影響。TTX敏感內(nèi)向電流是通過(guò)從總電流中減去TTX存在時(shí)的實(shí)驗(yàn)軌跡來(lái)確定的。超出控制的百分比值=[（處理AUC-NFA控制AUC）/ NFA控制AUC]×100。失活τ值是通過(guò)使用Origin（版本8.6，Origin實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)馬薩諸塞州北安普頓）將失活期間的后期電流軌跡擬合成指數(shù)衰減方程得到的。*表明，樣本均值顯著不同于對(duì)照組（NFA）卵母細(xì)胞（單樣本的學(xué)生t檢驗(yàn)，10-6 mol·L-1: P < 0.05）。CON：對(duì)照。

通過(guò)建立這一程序作為毒理學(xué)相關(guān)的體外試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)方案、數(shù)據(jù)采集標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)分析方法的創(chuàng)新變化進(jìn)行收集，大大提高了精度，從而提高了分析性能[18]。在本文的其余部分中，我們系統(tǒng)地研究了這些改進(jìn)并概述出一種可用于使用其他靶點(diǎn)和其他動(dòng)物/組織的通用方法，以提高類(lèi)似試驗(yàn)的性能。

4.1. 對(duì)提高卵母細(xì)胞整體健康的檢測(cè)水平的改變

為了改進(jìn)神經(jīng)膜微移植試驗(yàn)，通過(guò)將氯菊酯反應(yīng)與線性混合模型擬合確定變異源，隨機(jī)效應(yīng)與神經(jīng)膜制備、卵母細(xì)胞制備和單個(gè)卵母細(xì)胞有關(guān)。這些擬合的結(jié)果包括與每個(gè)來(lái)源（神經(jīng)膜制劑、卵母細(xì)胞制劑和卵母細(xì)胞）相關(guān)的估計(jì)方差分量。結(jié)果表明，與神經(jīng)膜制劑相關(guān)的方差分量比卵母細(xì)胞制劑和單個(gè)卵母細(xì)胞的方差分量小得多[18]。利用這些信息，我們進(jìn)行了一個(gè)系統(tǒng)的評(píng)估：①板內(nèi)單個(gè)蛙卵母細(xì)胞活力的變化（板內(nèi)變化）；②調(diào)整/最小化不同蛙卵母細(xì)胞組間質(zhì)膜神經(jīng)膜結(jié)合的變異性的程序（種間變異）。

根據(jù)原始方法使用的分析設(shè)置方案，很顯然，卵母細(xì)胞的整體健康水平和活力隨著完成完全濃度依賴(lài)性反應(yīng)曲線（CDRC）的時(shí)間的推移而下降，導(dǎo)致只有30%～50%的卵母細(xì)胞提供有用的數(shù)據(jù)（如TTX敏感的內(nèi)向電流）。為了盡量減少卵母細(xì)胞健康狀況的下降，對(duì)方案做了以下幾點(diǎn)改變：手術(shù)切除卵母細(xì)胞后，只對(duì)V期和VI期的健康卵母細(xì)胞進(jìn)行去核和選擇注射；在全分析微孔板中，96個(gè)卵母細(xì)胞在交錯(cuò)的時(shí)間點(diǎn)（每6 h）被注射0.5 mg·mL-1的神經(jīng)膜，以確保更一致的結(jié)合時(shí)間；只在電生理試驗(yàn)的進(jìn)行時(shí)間內(nèi)記錄放置在檢測(cè)板上的緩沖液中的卵母細(xì)胞；以及將記錄卵母細(xì)胞的時(shí)間間隔從15 min縮短到11 min。此外，在不同的微板之間交替使用擬除蟲(chóng)菊酯處理一排卵母細(xì)胞，奇數(shù)值濃度應(yīng)用于第3～5行，偶數(shù)濃度應(yīng)用于第6～8行。在下一次微 板測(cè)定時(shí)將這一順序顛倒，以此類(lèi)推，從而使任何潛在的板塊效應(yīng)最小化。

圖3. 存在NFA時(shí)，增加氯菊酯（a）和溴甲烷（b）濃度對(duì)微移植到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的幼年P(guān)ND15或成年P(guān)ND90大鼠腦神經(jīng)膜去極化誘發(fā)的TTX敏感電流的影響。

4.2. 數(shù)據(jù)采集標(biāo)準(zhǔn)的變化

建立了一個(gè)四步灌注的方法，對(duì)每個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行四次單獨(dú)的電生理掃描，以在數(shù)據(jù)分析之前選擇注射神經(jīng)膜的卵母細(xì)胞，這些卵母細(xì)胞都具有TTX敏感的內(nèi)向電流（TTX清洗方案）。先用1×ND96培養(yǎng)基和10-4mol·L-1NFA灌注卵母細(xì)胞2 min，然后進(jìn)行電生理記錄（掃描1）。然后用含有10-5mol·L-1TTX的1×ND96培養(yǎng)基和10-4mol·L-1NFA灌注卵母細(xì)胞2 min，并進(jìn)行第二次記錄（掃描2）。用1×ND96培養(yǎng)基和10-4mol·L-1NFA的灌注沖洗TTX 1 min。為了檢驗(yàn)擬除蟲(chóng)菊酯處理的效果，將氯菊酯或溴氰菊酯[5 ×10-9～1 × 10-6mol·L-1，置于1.0%二甲基亞砜（DMSO）中]和10-4mol·L-1NFA在1×ND96培養(yǎng)基中灌注5 min，并記錄另一次電生理測(cè)量結(jié)果（掃描3）。最后，每個(gè)卵母細(xì)胞在含有10-4mol·L-1NFA和10-5mol·L-1TTX的1×ND96培養(yǎng)基中再灌注2 min并記錄（掃描4）。每一次灌注均通過(guò)單獨(dú)的管道輸送，使用隔離的自動(dòng)閥門(mén)，以0.5 mL·min-1的速率進(jìn)行。在四次灌注后，記錄電流軌跡（掃描1～4），并進(jìn)行漏減方案。漏減產(chǎn)生了反映灌注處理效果的單一電流軌跡。如前所述[16,19]，該軌跡是從-100 mV保持電位到+60 mV持續(xù)50 ms的階躍（脈沖）去極化的結(jié)果。如前所述[20]，通過(guò)從總電流中減去TTX不敏感電流來(lái)確定TTX敏感的內(nèi)向電流。為了確定在NFA存在下是否發(fā)現(xiàn)了“內(nèi)向”TTX敏感電流，從掃描1中減去掃描2。選擇產(chǎn)生TTX敏感內(nèi)向電流在-100～4000 nA之間的卵母細(xì)胞（由AUC測(cè)量）用于數(shù)據(jù)分析。

這些板內(nèi)方案的改變將可用于平板數(shù)據(jù)分析的卵母細(xì)胞的比例從30%～50%提高到80%以上，這反映了神經(jīng)膜注入卵母細(xì)胞的整體健康狀況的顯著改善。雖然使用改善卵母細(xì)胞健康的卵母細(xì)胞選擇標(biāo)準(zhǔn)和方案能夠在分析板基礎(chǔ)上產(chǎn)生較少的變異性，但所獲得的數(shù)據(jù)仍然不夠一致，不足以進(jìn)行監(jiān)管評(píng)估。

4.3. 數(shù)據(jù)分析的變化減少了分析的可變異性

為減少在種間基礎(chǔ)上的可變性，使用方程（1）將AUC值轉(zhuǎn)換為對(duì)照響應(yīng)值的比例。

式中，VTR mean AUC是用70 μmol·L-1藜蘆定處理的每個(gè)卵母細(xì)胞檢測(cè)板的AUC平均值（VTR，一種持久的VSSC激活劑，與擬除蟲(chóng)菊酯不同的位點(diǎn)結(jié)合并作為陽(yáng)性對(duì)照）；Control mean AUC是每個(gè)沒(méi)有擬除蟲(chóng)菊酯或VTR處理的卵母細(xì)胞檢測(cè)板獲得的AUC的平均值（陰性對(duì)照）；treatment mean AUC是在擬除蟲(chóng)菊酯處理的情況下，從掃描4中減去掃描3得到的AUC。

通過(guò)該過(guò)程，特異性反應(yīng)范圍由未經(jīng)擬除蟲(chóng)菊酯或VTR處理的卵母細(xì)胞（陰性對(duì)照）和經(jīng)70 μmol·L-1VTR處理的卵母細(xì)胞（陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)擬除蟲(chóng)菊酯）的AUC的平均值限定。在沒(méi)有擬除蟲(chóng)菊酯處理的情況下，控制響應(yīng)的比例預(yù)計(jì)為0。隨著擬除蟲(chóng)菊酯濃度的增加，控制響應(yīng)的比例隨著擬除蟲(chóng)菊酯處理的卵母細(xì)胞AUC的增加而增加，接近最大值1.0。當(dāng)數(shù)據(jù)從0到1有界時(shí)，單個(gè)分析數(shù)據(jù)直接擬合到logit-log（廣義）線性回歸。

5. 結(jié)論

初步嘗試將小鼠腦神經(jīng)膜片段微移植到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，研究擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑對(duì)天然VSSC的影響，結(jié)果在NFA存在的情況下，檢測(cè)到去極化依賴(lài)的、TTX敏感的內(nèi)向電流隨著擬除蟲(chóng)菊酯濃度的增加而增加。這些創(chuàng)新的發(fā)現(xiàn)支持了這樣的觀點(diǎn)，即這項(xiàng)技術(shù)是一種和毒理學(xué)相關(guān)的有用的體外方法，用于研究神經(jīng)毒素和毒物在其原狀態(tài)下對(duì)其靶點(diǎn)的影響。盡管CDRC與生成它們的Hill方程完美地吻合，但由標(biāo)準(zhǔn)誤差確定的變化很大，因而在監(jiān)管情況下降低了它們的有用性。通過(guò)迭代方法，我們系統(tǒng)地檢查了檢測(cè)方案的變化，以提高卵母細(xì)胞的整體健康水平，并改進(jìn)數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析，如表1所示。

根據(jù)CDRC的標(biāo)準(zhǔn)誤差和改進(jìn)的總體R2值（圖4）來(lái)判斷，這些修改的方法可使CDRC的變異性大大降低，并顯著提高了分析精度，從而提高分析性能。利用這種改進(jìn)的方法，我們目前正在評(píng)估擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)幼年大鼠和成年大鼠腦神經(jīng)膜的天然VSSC的毒性動(dòng)力學(xué)的潛在年齡相關(guān)差異。

6. 未來(lái)發(fā)展的前景

非洲爪蟾卵母細(xì)胞質(zhì)膜片段微移植是一種體外方法，已被用于使用標(biāo)準(zhǔn)的電生理方法來(lái)研究天然態(tài)下的各種通道和受體[6-14]。令人遺憾的是，神經(jīng)膜結(jié)合的變異限制了它在定性分析方面的應(yīng)用。通過(guò)使用特定的阻斷劑（如TTX和NFA），我們能夠分離出一種去極化依賴(lài)的、TTX敏感的內(nèi)向鈉離子電流，這種電流是以濃度依賴(lài)的方式隨著擬除蟲(chóng)菊酯和滴滴涕濃度的增加而增加，通過(guò)延長(zhǎng)通道門(mén)控動(dòng)力學(xué)的失活過(guò)程，模擬它們對(duì)卵母細(xì)胞中異源表達(dá)的單個(gè)VSSC的作用，從而驗(yàn)證了基于神經(jīng)膜的方法。此外，將VTR（VSSC的一種特異性激活劑）加入陽(yáng)性對(duì)照中，可以使不同批次卵母細(xì)胞之間的神經(jīng)膜結(jié)合規(guī)范化，減少變異性，并促使該分析在定量方面有用。以這種方式，上述創(chuàng)新變化的集合概述了一種通用方法，可用于使用其他靶點(diǎn)和其他動(dòng)物/組織提高類(lèi)似試驗(yàn)的性能。重要的是，對(duì)于各種電壓和配體門(mén)控的通道和受體，選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑的可用性豐富且不斷增加，這些通道和受體可如上所述用于提高分析性能。此外，已經(jīng)證實(shí)該方法可以利用從尸體組織樣本中獲得的人腦碎片發(fā)揮作用[11]；這允許直接比較人體靶位點(diǎn)上與非人類(lèi)動(dòng)物模型靶點(diǎn)上的毒物，從而驗(yàn)證了我們當(dāng)前的動(dòng)物模型的有用性。雖然目前這只是個(gè)推測(cè)，但有許多非神經(jīng)組織（脂肪、肝臟、肌肉等）具有與神經(jīng)組織相同的靶點(diǎn)[如VSSC、煙堿型乙酰膽堿受體、γ-氨基丁酸（GABA）-氯離子通道、甘氨酸-氯離子通道等]，它們都可以用上述分析方法進(jìn)行研究。特別是，常見(jiàn)的環(huán)境污染物如多氟烷基物質(zhì)（PFAS）和農(nóng)藥對(duì)這類(lèi)非靶組織的作用尚未得到詳細(xì)研究，盡管它們?cè)诖x綜合征中的作用（包括肥胖和2型糖尿病發(fā)病率的增加）已被廣泛認(rèn)可。

表1 減少神經(jīng)膜注射卵母細(xì)胞試驗(yàn)的變異性的步驟，以獲得隨著擬除蟲(chóng)菊酯濃度增加而產(chǎn)生的更一致的CDRC

圖4. NFA存在下，成年P(guān)ND90大鼠腦神經(jīng)膜微移植到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的擬除蟲(chóng)菊酯CDRC混合模型回歸分析。（a）氯菊酯和溴氰菊酯的未調(diào)整數(shù)據(jù)集顯示為超過(guò)對(duì)照反應(yīng)的百分比；（b）使用分析改進(jìn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集，以減少氯菊酯和溴氰菊酯的變異性，以對(duì)照反應(yīng)所占比例的logit-log表示。

Acknowledgements

This work was supported by the Council of the Advancement of Pyrethroid Human Risk Assessment(CAPHRA) (#S17110000000004).

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