正交試驗優(yōu)選艾納香配方顆粒的提取工藝

蔡雪梅，王志萍，謝譚芳，陳 健，李林霜

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術學院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；3.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 連云港 222002）

艾納香為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的干燥地上部分，別名為大風艾、牛耳艾等，具有祛風除濕、消腫止痛等功效［1-2］，民間常用于產后祛風除濕、殺菌止癢。中藥配方顆粒具有免煎煮、攜帶方便、容易儲存等優(yōu)點［3-4］，是中藥飲片發(fā)展的趨勢。本實驗以艾納香的有效成分原兒茶酸的含量為考察指標，以提取次數(shù)、提取時間、加水倍量作為考察因素，采用正交試驗法對艾納香配方顆粒的提取工藝進行優(yōu)化。

1 實驗材料

1.1 儀器 SQP YJ-04、CPA225D 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；UPC-II-10T 超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；KQ3200B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；98-I-B 電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；島津LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）。

1.2 材料 艾納香藥材購自南寧水街，經廣西中醫(yī)藥大學田慧教授鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的干燥地上部分；原兒茶酸對照品（批號110809-201205，含量為99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 原兒茶酸的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：美國Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92），采用等度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為0.8 ml/min；進樣量為15μl；檢測波長為256 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 取原兒茶酸對照品適量，精密稱定，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.145 mg/ml 原兒茶酸對照品溶液母液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入12 倍量水浸泡使藥材充分濕潤，浸泡90 min 后加熱回流提取30 min，趁熱使用400目濾布濾過；殘渣再加入10倍水回流提取20 min，濾過，合并過濾液，再加水定容至一定體積，搖勻。取藥液2 ml，離心15 min（13 000 r/min），將上清液用0.22μm 微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.1.4 陰性溶液的制備 取甲醇溶液2 ml，用0.22μm微孔濾膜濾過，濾液即為陰性溶液。

精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性溶液各15μl，按“2.1.1”色譜條件進樣，記錄色譜峰。原兒茶酸保留時間為11.87 min，與供試品其他成分分離度良好（R＞1.5），陰性溶液對測定無干擾。見圖1。

圖1 原兒茶酸含量測定HPLC色譜圖

2.1.5 線性關系考察 精密吸取2.0 ml原兒茶酸對照品溶液母液至25 ml的容量瓶中，加入甲醇稀釋，配制成原兒茶酸濃度為91.6μg/ml 的對照品溶液次母液，精密吸取0.2 ml、0.5 ml、2.0 ml、4.0 ml、8.0 ml、10 ml 原兒茶酸對照品次母液，分別置于10 ml的容量瓶中，加入甲醇稀釋定容至刻度，將稀釋定容后的對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件測定并記錄峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液濃度為橫坐標（X，μg/ml），進行線性回歸并繪制標準曲線。得到線性方程Y=72 437X-9 308.8（r=0.999 7），表 明原 兒茶 酸 濃度 在1.832～91.600μg/ml與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下的對照品溶液，按“2.1.1”色譜條件連續(xù)自動進樣6 針，記錄下峰面積并計算RSD 值。在精密度試驗中，原兒茶酸對照品的平均峰面積為51 333 583，RSD 值為0.99%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 平行稱取艾納香藥材粗粉（批號20180105）6 份，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”色譜條件分別進樣，記錄峰面積并計算RSD 值。在重復性試驗中，6 份樣品原兒茶酸峰面積平均值為190 521，RSD=1.51%（n=6），原兒茶酸平均含量為0.056 mg/g，RSD=1.30%（n=6），表明此方法的重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 稱取艾納香藥材粗粉適量（批號20180105）1 份，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 進樣，記錄峰面積并計算含量及RSD值。在穩(wěn)定性試驗中，6 個時間點測定的平均含量為0.066 mg/g，RSD 為0.18%（n=6），表明待測樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱量重復性試驗項下已測知含量的艾納香藥材粗粉6份，每份約50 g，按照藥材原兒茶酸的含量，按照1∶1比例，加入一定量的原兒茶酸對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”色譜條件分別進樣，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果加樣回收率的平均值為98.40%，RSD值為1.10%（n=6）。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 （n=6）

2.2 單因素考察提取工藝

2.2.1 提取溶劑倍量的考察 稱取一定量的藥材粗粉于圓底燒瓶中，共8 份，分別加入8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水，浸泡90 min，回流提取60 min，過濾，取濾液2 ml 離心15 min（13 000 r/min），取上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，續(xù)濾液用于測定原兒茶酸的含量。結果8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水對應的原兒茶酸的含量分別為0.033 mg/g、0.037 mg/g、0.041 mg/g、0.042 mg/g、0.044 mg/g、0.045 mg/g、0.049 mg/g、0.049 mg/g。表明隨著加水倍量的增加，原兒茶酸的含量呈現(xiàn)上升的趨勢，因此選取提取溶劑8、14、20倍量進行正交試驗。

2.2.2 提取次數(shù)的考察 稱取一定量的藥材粗粉5份，置于圓底燒瓶中，分別加入20 倍量水浸泡90 min，分別回流提取1、2、3、4、5 次，每次60 min，過濾藥渣，合并濾液。取濾液2 ml 離心15 min（13 000 r/min），將上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于測定原兒茶酸的含量。結果回流提取1、2、3、4、5次得到的原兒茶酸含量分別為0.053 mg/g、0.092 mg/g、0.101 mg/g、0.106 mg/g、0.106 mg/g，因此選擇提取1、2、3次為考察水平。

2.2.3 提取時間的考察 稱取一定量的藥材粗粉6份，分別加入20 倍量水浸泡90 min，分別回流提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，過濾，取濾液2 ml 離心15 min（13 000 r/min），將上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液測定原兒茶酸的含量。結果得到的原兒茶酸含量分別為0.037 mg/g、0.038 mg/g、0.039 mg/g、0.044 mg/g、0.042 mg/g、0.042 mg/g。結合生產企業(yè)的時間效益和經濟效益，因此選擇提取30 min、60 min、90 min為考察水平。

2.3 正交設計優(yōu)化提取工藝

2.3.1 因素水平 根據(jù)單因素考察結果，結合對大生產的環(huán)境、經濟效益等實際情況的考慮，以原兒茶酸含量為評價指標，本實驗選取加水倍量、提取時間、提取次數(shù)這3個對提取效果影響較大的因素進行正交試驗設計，考察因素水平表見表2。

表2 因素水平表

2.3.2 正交試驗 稱取艾納香藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，按表3正交試驗方案安排進行試驗，合并過濾液，搖勻。取藥液2 ml，離心15 min（13 000 r/min），將上清液用0.22μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”色譜條件進樣測定。正交試驗方案安排及結果見表3，方差分析見表4、表5。

表3 正交試驗方案安排與結果

表4 方差分析結果

表5 因素B與誤差合并后的方差分析結果

由于因素B 與誤差小，故可與誤差合并。從表4和表5 結果可知，三個影響因素的大小為A＞C＞B，且A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，其中A、C 因素對提取的影響具有顯著性意義，B1、B2與B3相差不大，因此，篩選出的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3，即在艾納香藥材中加20倍量水，提取3次，每次30 min。

2.4 驗證試驗 按優(yōu)選出的最佳工藝對艾納香進行提取3次，結果原兒茶酸含量高于正交試驗中的結果，表明優(yōu)選的工藝可行。見表6。

表6 提取工藝驗證試驗結果

3 討 論

本實驗在建立艾納香提取液中原兒茶酸含量測定的方法中，進行了流動相的考察，比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比例（8∶92和10∶90）的分離效果，根據(jù)分離度要求，最終選擇了乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92）作為流動相；對流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）和進樣量（5μl、10μl、15μl、20μl）也進行了考察，最終根據(jù)色譜峰的峰形及色譜峰峰面積，選擇了流速為0.8 ml/min，進樣量為15 μl；并參考相關文獻［5-6］中的測定波長，選定為256 nm。所建立的HPLC 含量測定方法，線性關系良好，靈敏度高，具有簡單、準確的特點，可作為艾納香提取液的定量分析方法。

本研究在單因素基礎上對艾納香藥材的提取工藝進行了正交設計優(yōu)化，篩選出最優(yōu)提取工藝，即在艾納香藥材中加20 倍量水，提取3 次，每次30 min。并對此工藝進行了驗證，結果表明提取工藝穩(wěn)定可靠、可行性好，可為艾納香配方顆粒的制備提供參考依據(jù)。

（注：本文實驗數(shù)據(jù)源自蔡雪梅在廣西中醫(yī)藥大學攻讀碩士的畢業(yè)論文）