多波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定丹七粉中7個(gè)有效成分的含量

陳天山，黃慧學(xué)

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541001）

丹七粉由丹七片改進(jìn)而成，具有活血化瘀、通脈止痛的功效，用于瘀血閉阻所致的胸痹心痛、眩暈頭痛、經(jīng)期腹痛［1］。其處方由丹參和三七兩味中藥組成。丹參的化學(xué)成分包括水溶性和脂溶性?xún)纱蟛糠?，水溶性成分以丹酚酸B 含量最高；脂溶性的丹參酮類(lèi)主要包括隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA。三七的主要有效成分為三七總皂苷，其中以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量較高。《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部丹七片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收載丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮及丹酚酸B 的定量方法。為了更好地控制丹七粉的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法，對(duì)丹七粉中的隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸B 及三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行含量測(cè)定，為建立丹七粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；MS105DU 型分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；YP-B5002 型電子天平（北京浩天暉科貿(mào)易有限公司）；JP-080S 型超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；Milli-Q 超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑與試藥 丹參酮ⅡA對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：181011）；隱丹參酮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110852-201808）；丹參酮Ⅰ對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110867-201609）；丹酚酸B 對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：181228）；三七皂苷R1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-201819）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-18080116）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-19012811）；乙腈、甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水；丹七粉（自制10 批，批號(hào)：190601、190602、190603、190604、190605、190606、190607、190608、190609、190610）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取本品約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水（8∶2）混合溶液50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇-水（8∶2）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇-水（8∶2）混合溶液配成每1 ml 含丹酚酸B 200.0 μg、隱丹參酮10.0μg、丹參酮Ⅰ5.0μg、丹參酮ⅡA15.0μg、三七皂苷R140.0μg、人參皂苷Rg1200.0μg、人參皂苷Rb1100.0μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 陰性溶液的制備 分別取缺丹參、三七的陰性樣品，按2.1 項(xiàng)下的方法制成缺丹參和缺三七的陰性對(duì)照溶液，即得。

2.4 色譜條件 以Waters SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫30 ℃；流速1.0 ml/min；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；丹酚酸B的檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。

表1 洗脫程序

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 用自動(dòng)進(jìn)樣器分別吸取每1 ml含丹酚酸B 2.04 mg、隱丹參酮0.12 mg、丹參酮Ⅰ0.06 mg、丹參酮ⅡA0.16 mg、三七皂苷R10.42 mg、人參皂苷Rg12.02 mg、人參皂苷Rb11.02 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5μl、1μl、3μl、5μl、10μl、20μl，按照2.4 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得各對(duì)照品的回歸方程及線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2，表明7 種成分在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，按2.4 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明陰性溶液對(duì)丹七粉中主要有效成分的色譜峰無(wú)干擾，各對(duì)照品峰形良好（見(jiàn)表3、圖1、圖2、圖3、圖4）。

表2 線(xiàn)性關(guān)系考察

表3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 對(duì)照品圖譜

圖2 供試品圖譜

圖3 缺丹參的陰性對(duì)照?qǐng)D譜

圖4 缺三七的陰性對(duì)照?qǐng)D譜

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄各主要有效成分的峰面積，計(jì)算RSD 分別為0.41%、1.22%、0.55%、0.97%、0.36%、0.89%、0.53%（均n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹七粉（批號(hào)：190601）6 份，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取10μl 供試品溶液，注入液相色譜儀，分別測(cè)定供試品中各主要有效成分的含量，計(jì)算RSD 分別為0.93%、0.45%、0.39%、0.81%、0.62%、1.13%、0.78%（均n=6），表明該測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批丹七粉（批號(hào)：190601）6 份，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取10μl 供試品溶液，注入液相色譜儀，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定并記錄各主要有效成分的峰面積，計(jì)算RSD 分別為1.04%、0.54%、0.48%、0.72%、0.91%、1.01%、0.63%（均n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取丹七粉0.25 g（丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量分別為25.65 mg/g、0.91 mg/g、0.61 mg/g、1.52 mg/g、4.54 mg/g、22.59 mg/g、13.67 mg/g）6 份，精密稱(chēng)定，分別精密加入每1 ml 含丹酚酸B 2.04 mg、隱丹參酮0.12 mg、丹參酮Ⅰ0.06 mg、丹參酮ⅡA0.16 mg、三七皂苷R10.42 mg、人參皂苷Rg12.02 mg、人參皂苷Rb11.02 mg的對(duì)照品溶液3.0 ml，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，回收率見(jiàn)表4、表5，表明建立的丹七粉高效液相色譜檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高。

2.11 樣品含量測(cè)定 按照本試驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法，測(cè)定10批丹七粉的有效成分含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討 論

經(jīng)查閱近年來(lái)丹七片的相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)丹參酮類(lèi)的含量測(cè)定及多波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定丹七片中多種有效成分的研究報(bào)道，僅有采用HPLC 測(cè)定丹酚酸B 及三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的報(bào)道。其中丹酚酸B的提取方法多樣：廖名愛(ài)等［2-4］采用50%乙醇超聲處理30 min；夏明［5］先用稀鹽酸酸化后再用乙酸乙酯萃取3 次；馮彬彬等［6］采用75%甲醇加熱回流1 h。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的提取方法主要有：梁少?gòu)?qiáng)等［7-8］采用50%甲醇超聲處理30 min；蔡向陽(yáng)等［9］采用水飽和的正丁醇超聲處理30 min。本實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版一部收載的丹七片的標(biāo)準(zhǔn)，采用甲醇-水（8∶2）混合溶液超聲處理30 min，取得了較好的提取效果。

表4 丹參有效成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

表5 三七有效成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

表6 10批丹七粉含量測(cè)定結(jié)果

文獻(xiàn)［2-5］報(bào)道丹酚酸B 的HPLC 含量測(cè)定的色譜條件基本一致；流動(dòng)相組成為甲醇-乙腈-甲酸-水，檢測(cè)波長(zhǎng)均為286 nm。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的分離方法主要有：梁少?gòu)?qiáng)等［7-8］以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫分離；蔡向陽(yáng)等［9］以乙腈-水-磷酸（20.5∶79.5∶0.02）為流動(dòng)相進(jìn)行分離；檢測(cè)波長(zhǎng)均為203 nm。金銀芝［10］、應(yīng)佳［11］測(cè)定丹七片中人參皂苷Rg1的含量，以甲醇-水為流動(dòng)相，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為280 nm。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［13］以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，各有效成分的檢測(cè)波長(zhǎng)與文獻(xiàn)一致，取得了良好的分離效果。

丹七粉由丹七片改進(jìn)而成，原劑型丹七片采用加水煎煮3 次的方式提取丹參的有效成分，由于丹參酮類(lèi)為脂溶性成分，該提取方法導(dǎo)致丹參酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)移率較低［13］。經(jīng)劑型改進(jìn)后，丹七粉中的丹參酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)移率及含量得到了較大提高，需對(duì)該類(lèi)有效成分進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)；同時(shí)丹酚酸B 也是丹七粉發(fā)揮療效的主要有效成分，因此本實(shí)驗(yàn)在《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部丹七片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量測(cè)定方法。本研究采用多波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定丹七片中主要有效成分的含量，所建立的方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，進(jìn)一步提高了丹七粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。