結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)v3425對(duì)細(xì)菌表型及毒力影響的研究

趙雅敏，朱勝玲，翁術(shù)鋒，張?zhí)烊?，王洪海，徐穎

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200433

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)引起的慢性傳染病。2019年WHO公布2018年全球約有 1 000 萬人罹患結(jié)核病，死亡人數(shù)高達(dá)120萬人[1]，結(jié)核病的防治仍然面臨很大的挑戰(zhàn)。

結(jié)核分枝桿菌作為結(jié)核病的病原菌，通過呼吸道進(jìn)入宿主肺泡巨噬細(xì)胞后，能快速并準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)換其代謝途徑來適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境，同時(shí)利用巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞躲避宿主的免疫攻擊，導(dǎo)致潛伏感染[2]，然而造成結(jié)核分枝桿菌潛伏及致病的具體機(jī)制至今尚未研究透徹。結(jié)核分枝桿菌和鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium，M.avium)等致病性分枝桿菌的基因組中大約有10%的開放讀碼框架(open reading frame，ORF)編碼PE/PPE家族蛋白，這些蛋白能夠影響菌株的毒力及其與宿主之間的相互作用[3]。例如，針對(duì)PPE11的研究發(fā)現(xiàn)，其可影響結(jié)核分枝桿菌的成膜能力和抗逆環(huán)境的能力，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)[4-5]；PE-PGRS30則被證明能抵抗巨噬細(xì)胞中的酸性環(huán)境，從而維持結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)生存[6]。Basu等研究發(fā)現(xiàn)，PE_PGRS33和PPE34均能結(jié)合Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)而激活巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，并誘導(dǎo)促進(jìn)凋亡和壞死的細(xì)胞因子釋放[7-8]。研究表明，PE/PPEs家族在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。進(jìn)一步探究其相關(guān)機(jī)制對(duì)于了解結(jié)核分枝桿菌的潛伏及開展結(jié)核病的防御治療具有深遠(yuǎn)的意義。

經(jīng)結(jié)核分枝桿菌與卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)的基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌基因組的一些片段在BCG中缺失，此類缺失的片段被稱為差異區(qū)域(region of differences, RD)，RD區(qū)被認(rèn)為可能與結(jié)核分枝桿菌的毒力和宿主免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[2]。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株RD-11編碼5個(gè)蛋白，分別為Rv3427c、Rv3428c、Rv3425、Rv3426和Rv3429，其中Rv3425、Rv3426和Rv3429是PPE蛋白家族成員[9]。 基因rv3425編碼蛋白PPE57(即Rv3425)， 它是一個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原，可激發(fā)體液免疫反應(yīng)。用重組PPE57蛋白作為包被抗原時(shí)，結(jié)核病患者與卡介苗接種者的血清陽性率有顯著差異，這表明PPE57能有效區(qū)分結(jié)核病患者與卡介苗接種者，對(duì)結(jié)核病的診斷有較高應(yīng)用價(jià)值[10]。重組PPE57蛋白聯(lián)合佐劑免疫小鼠，可誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)并高水平分泌γ干擾素(IFN-γ)，同時(shí)產(chǎn)生高效價(jià)的IgG1抗體[11]。PPE57還能結(jié)合巨噬細(xì)胞TLR2受體，激活下游MAPKs/NF-κB信號(hào)通路，顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子〔腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-12以及IL-6〕并促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子和共刺激分子表達(dá)[12]，這些研究都顯示該蛋白是一種可用于疫苗構(gòu)建的候選抗原。本研究以恥垢分枝桿菌野生株(Ms)為模式菌株，構(gòu)建了重組恥垢分枝桿菌Ms-Pact和Ms-Rv3425，并比較它們?cè)诰湫螒B(tài)、成膜能力、疏水性等方面的差異和對(duì)逆境的耐受能力；針對(duì)廣譜抗生素及結(jié)核分枝桿菌特異性藥物的抗性，探討Rv3425蛋白的功能。分析在不同逆境條件下培養(yǎng)的H37Ra中Rv3425內(nèi)源表達(dá)量的變化，并通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察Rv3425對(duì)菌株的胞內(nèi)存活及毒力的影響。期望本研究結(jié)果對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和治療有所幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Ra為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，質(zhì)粒Pact、Pact-Rv3425為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒，THP-1細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，6～8周齡的BALB/c雄性小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，葡萄糖、氯化鈉、乙酰胺、丙三醇、Tween-80、Tween-20、Tris、甘氨酸、PBS、油酸、4%多聚甲醛以及實(shí)驗(yàn)室常用抗生素購于生工生物工程(上海)股份有限公司，Middlebrook7H9、Middlebrook7H10培養(yǎng)基購于美國BD公司，牛血清白蛋白(bovine albumin)購于美國AMRESCO公司，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、慶大霉素、過氧化氫酶catalase購于美國Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)基RPM1640、胎牛血清、青/鏈霉素混合液(100x) 購于美國ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 重組恥垢分枝桿菌Ms-Pact、Ms-Rv3425的構(gòu)建將質(zhì)粒Pact、Pact-Rv3425經(jīng)乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)進(jìn)恥垢分枝桿菌Ms感受態(tài)中，加入不含Tween-80的7H9-OADC培養(yǎng)基(5% BSA、0.03%過氧化氫酶、 2%葡萄糖、0.85%氯化鈉、0.01%油酸)，37 ℃靜置孵育2 h，涂布于含有30 μg/mL 卡那霉素的7H10-OADC平板上，待長出菌落挑至7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L，誘導(dǎo)12 h后行蛋白印跡法驗(yàn)證。

1.2.2 生長曲線的測定將菌株Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425接種于7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；將菌液OD600調(diào)成一致，以1∶100轉(zhuǎn)接入含有100 mL 7H9-ODAC培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)；每隔一段時(shí)間取樣，梯度稀釋涂平板，待長出菌落后進(jìn)行數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.3 菌落形態(tài)的觀察將菌株Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425接種于7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L誘導(dǎo)6 h；梯度稀釋涂板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d；宏觀變倍體顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 聚集能力分析將菌株Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425接種于蘇通液體培養(yǎng)基中，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；于室溫靜置5 h，比較它們的疏松度并拍照。

1.2.5 成膜能力分析生物膜形成的觀察：將菌株Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425接種于7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8；以1∶100的比例轉(zhuǎn)接入蘇通培養(yǎng)基中，調(diào)OD600=0.05；加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L，37 ℃靜置培養(yǎng)；分別在第1.5、2、3、5、7、9天觀察生物膜的形成及脫落情況并拍照記錄。

結(jié)晶紫成膜定量實(shí)驗(yàn)：將Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425菌株接種于7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8；以1∶100的比例轉(zhuǎn)接入蘇通培養(yǎng)基中，調(diào)OD600=0.05，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L；轉(zhuǎn)入96孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；分別在第1.5、2、3、5天棄掉培養(yǎng)基，用無菌水清洗2次；1%的結(jié)晶紫染色液染色30 min，吸掉染色液，并用無菌水清洗至洗滌液接近無色；加入100%乙醇 200 μL/孔，靜置1 h；檢測OD570的吸收值。

1.2.6 抗逆性及抗藥性分析將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的Ms-Pact、Ms-Rv3425菌液調(diào)至OD600=1；以1︰50分別轉(zhuǎn)接入pH5.0、pH5.5， 0.02%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、0.1% SDS，750 μg/mL氨芐西林，16 μg/mL、64 μg/mL的利福平/異煙肼的7H9-OADC培養(yǎng)基，加入乙酰胺至終濃度34 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)一定時(shí)間后，取菌液稀釋涂板，37 ℃靜置培養(yǎng)，3 d后進(jìn)行數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.7 逆境條件下H37Ra中Rv3425表達(dá)量的檢測將H37Ra接入7H9-OADC培養(yǎng)基活化至對(duì)數(shù)期；以1∶100分別轉(zhuǎn)接入pH5.0、pH5.5，5mmol/L H2O2、10 mmol/L H2O2，250 μg/mL氨芐西林、500 μg/mL氨芐西林，0.02% SDS的7H9-OADC培養(yǎng)基并在低氧條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)H37Ra菌株；3周后收菌，蛋白印跡法檢測 Rv3425蛋白的表達(dá)。

1.2.8 細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇并培養(yǎng)THP-1細(xì)胞 (37 ℃、5%CO2)至狀態(tài)良好后進(jìn)行鋪板，加入50 ng/mL 乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激THP-1細(xì)胞，連續(xù)刺激2～3 d使其分化。將菌液以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10加入細(xì)胞感染4 h；加入20 μg/mL慶大霉素處理2 h，殺死胞外菌；PBS清洗每孔3次，補(bǔ)加1 mL新鮮1640完全培養(yǎng)基；分別在0、6、18、24 h吸去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 0.025% SDS裂解細(xì)胞，梯度稀釋涂板；2～3 d后，待其形成肉眼可見菌落時(shí)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用6周齡的BALB/c雄性小鼠，提前放入動(dòng)物房適應(yīng)1周；將63只小鼠分為4組，其中Ms組20只，Ms-Pact組20只，Ms-Rv3425組20只，PBS組3只；制作攻毒菌懸液：取乙酰胺誘導(dǎo)后對(duì)數(shù)生長期的菌20 mL，3 750 rpm室溫離心10 min去上清液，收集細(xì)菌沉淀物，5 mL PBS洗 2次；加入5 mL PBS重懸菌體，500 rpm離心5 min，收集上層充分懸浮的菌液，用PBS調(diào)OD600=0.8(約2×108CFU/mL)用PBS稀釋成所需濃度。尾靜脈注射相應(yīng)菌液100 μL，每只小鼠的攻毒量約為5×107CFU[13-14]，PBS組注射100 μL PBS；每天觀察小鼠的狀態(tài)及生存狀況；分別于2、7 d，每組小鼠各取5只，對(duì)照組1只，頸椎脫臼處死并進(jìn)行解剖，分離肝臟、脾臟和右肺，研磨組織，10倍梯度稀釋，選擇合適梯度進(jìn)行涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)，2～3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；同時(shí)取小鼠左肺，用4%的多聚甲醛固定，送至賽維爾公司進(jìn)行HE染色分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ms-Rv3425的構(gòu)建及其表達(dá)量鑒定

在細(xì)菌生長到OD600=0.5時(shí)，加入34 mmol/L乙酰胺誘導(dǎo)12 h，收集5 mL菌液，超聲破碎獲取細(xì)菌總蛋白，用anti-Rv3425單克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡法檢測。圖1A顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass，Mr)為 19 000 附近有條帶，為目的蛋白R(shí)v3425，表明Ms-Rv3425構(gòu)建成功。圖1B結(jié)果顯示，相比于OD600=0.5的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)以及28 mmol/L乙酰胺的誘導(dǎo)濃度，在Ms-Rv3425生長到OD600=0.8時(shí)加入34 mmol/L乙酰胺誘導(dǎo)，Rv3425的表達(dá)量最高。由于分枝桿菌內(nèi)參確定困難，本研究用Bicinchoninic acid(BCA)法對(duì)全菌蛋白定量并進(jìn)行SDS-PAGE，通過考馬斯亮藍(lán)染色以確定總蛋白上樣量一致，如圖1C。

A: Immunolocalization of Rv3425 in recombinant M.smegmatis Ms-Rv3425. 1-3: cell lysate of Ms-Rv3425; 4: cell lysate of Ms-Pact; 5: purified Rv3425. B: Expression levels of Rv3425 in different periods and under different induction conditions. 1: purified Rv3425; 2-4: cell lysate of Ms-Rv3425 induced with 28 mmol/L acetamide at OD600=0.5, at 6 h/12 h/24 h; 5-7: cell lysate of Ms-Rv3425 induced with 28 mmol/L acetamide at OD600=0.8, at 6 h/12 h/24 h; 8-10: cell lysate of Ms-Rv3425 induced with 34 mmol/L acetamide at OD600=0.5, at 6 h/12 h/24 h; 11-13: cell lysate of Ms-Rv3425 induced with 34 mmol/L acetamide at OD600=0.8, at 6 h/12 h/24 h. C: Coomassie blue staining of Ms-Rv3425-induced expression of whole bacteria protein. 1: protein marker; 2-13: are consistent with B2-13.

2.2 外源轉(zhuǎn)入Rv3425對(duì)細(xì)菌生長無影響

在不同時(shí)間點(diǎn)，取培養(yǎng)的Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425，梯度稀釋涂板進(jìn)行菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，Ms、Ms-Pact和Ms-Rv3425的生長速率無差異，表明外源轉(zhuǎn)入Rv3425不影響恥垢分枝桿菌的體外增殖(圖2)。

Colony-forming units of Ms, Ms-Pact and Ms-Rv3425 at intervals at 37 ℃, 100 rpm.

2.3 外源轉(zhuǎn)入Rv3425對(duì)菌落形態(tài)及細(xì)菌聚集度的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的3種菌涂布于7H10-OADC平板上，4 d后在宏觀變倍體式顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，Ms-Pact和Ms的菌落形態(tài)相似，比較扁平，褶皺比較細(xì)；而Ms-Rv3425的菌落整體比較圓潤，邊緣的暈比較厚，菌落中央高突隆起(圖3A)。

將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)至靜置培養(yǎng)5 h，觀察3種菌株聚集度的差異。結(jié)果顯示，在添加Tween-80和不添加Tween-80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48 h后，Ms-Pact、Ms-Rv3425的細(xì)菌數(shù)量幾乎是相同的，但是Ms-Rv3425明顯更松散，聚集度差(圖3B)。

2.4 外源轉(zhuǎn)入Ms-Rv3425增強(qiáng)了Ms的成膜能力

用不含Tween-80的7H9-OADC培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)Ms、Ms-Pact、Ms-Rv3425，分別在第1、1.5、2、3、4、5、7 天記錄并分析其成膜情況。結(jié)果顯示，在第1.5 天時(shí)，逐漸開始形成生物膜，到第5天菌膜開始脫落。Ms-Rv3425形成生物膜明顯早于Ms-Pact，且菌膜面積更大、更厚，褶皺更加明顯(圖4A、4B)。 此外， 分別在第1.5、2、3、5天用結(jié)晶紫對(duì)菌膜染色行定量分析，結(jié)果如圖4C顯示，在第1.5、2、3天，Ms-Rv3425成膜量都高于Ms-Pact，P<0.000 5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A: Enlarged view of single colony of Ms, Ms-Pact and Ms-Rv3425. B: Aggregate formation by Ms, Ms-Pact and Ms-Rv3425.

A: Pellicle formation in standing cultures of Ms-Pact and Ms-Rv3425 at different times. B: Pellicle formation in standing cultures of Ms, Ms-Pact and Ms-Rv3425 at 48h. C: Quantitative measurement of the biofilm formation by crystal violet staining. ***: P<0.0005; ****: P<0.0001.

2.5 Rv3425的表達(dá)增強(qiáng)了Ms的抗逆性及抗藥性

模擬巨噬細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，在0.02% SDS、0.1% SDS，pH5.5、pH5.0這幾種逆境條件下培養(yǎng)Ms-Pact和Ms-Rv3425，比較2種菌存活率，分析Rv3425與結(jié)核分枝桿菌抵抗逆境的關(guān)系。結(jié)果顯示，Ms-Rv3425抗表面活性劑和耐酸能力顯著增強(qiáng)(圖5A)。此外，用含750 μg/mL氨芐西林、16 μg/mL異煙肼、64 μg/mL異煙肼、16 μg/mL利福平、64 μg/mL利福平的7H9-OADC培養(yǎng)基培養(yǎng)上述2種菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ms-Rv3425對(duì)氨芐西林、異煙肼、利福平的耐受性更強(qiáng)(圖5B)。

2.6 H37Ra中Rv3425的內(nèi)源表達(dá)量在逆境條件下顯著上調(diào)

為進(jìn)一步探討Rv3425表達(dá)量與菌株適應(yīng)逆境環(huán)境之間的關(guān)系，在低pH值、低氧、5 mmol/L H2O2、10 mmol/L H2O2、250 μg/mL氨芐西林、500 μg/mL氨芐西林、0.02% SDS條件下培養(yǎng)H37Ra，并檢測Rv3425的內(nèi)源表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，H37Ra菌株在低pH、低氧環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，Rv3425顯著上調(diào)；在250 μg/mL 氨芐西林、500 μg/mL 氨芐西林、0.02% SDS環(huán)境中，Rv3425的表達(dá)也略有上調(diào)；而在不同濃度H2O2條件下培養(yǎng)時(shí)，Rv3425的內(nèi)源表達(dá)量無顯著變化(圖6)，這一結(jié)果也與上述抗逆實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

2.7 外源轉(zhuǎn)入Rv3425增強(qiáng)了Ms的毒力

THP-1細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Ms-Rv3425組的侵染效率最高，在胞內(nèi)存活能力也顯著強(qiáng)于Ms及Ms-Pact組(圖7A)。BALB/c小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，外源轉(zhuǎn)入Rv3425增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌的毒性，如圖7B所示，Ms-Rv3425組的小鼠從第2天開始死亡，到第20天共死亡7只；Ms-Pact組小鼠共死亡4只；Ms組小鼠則無死亡。Ms-Rv3425組與Ms-Pact組相比，P=0.016，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于脾、肺、肝3種臟器的載菌量檢測結(jié)果顯示，在脾和肺中，Ms-Rv3425組與Ms-Pact組差異不顯著(圖7C)。各臟器的病理切片結(jié)果如圖7D所示，Ms-Rv3425組小鼠的臟器病變程度要顯著強(qiáng)于Ms組和Ms-Pact組，Ms-Rv3425組肝竇輕度淤血，擴(kuò)張程度大，伴有大量胞核固縮深染，且有多處炎癥細(xì)胞灶性浸潤；脾臟中多核巨細(xì)胞增多，紅髓和白髓界限不清，紅髓減少，白髓增多，脾小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)；肺中也出現(xiàn)了明顯的組織浸潤。細(xì)胞感染與小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，表明外源轉(zhuǎn)入Rv3425能夠顯著增強(qiáng)恥垢分枝桿菌的毒力。

3 討論

分枝桿菌屬具有復(fù)雜菌落形態(tài)和生物膜，與毒力相關(guān)缺乏生物膜的鳥分枝桿菌和海分枝桿菌的轉(zhuǎn)座子突變體在耐藥性及細(xì)胞侵染能力方面都有所減弱[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)Ms-Rv3425與Ms及Ms-Pact相比，菌落形態(tài)更加粗糙隆起，生物成膜能力更強(qiáng)，耐脅迫、抗異煙肼等結(jié)核藥物的能力顯著上升。此外，H37Ra在低氧、低pH值等壓力條件下Rv3425的內(nèi)源表達(dá)量顯著上調(diào)。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁厚，與細(xì)胞壁核心共價(jià)結(jié)合的霉菌酸和游離脂質(zhì)形成高度不透水外膜賦予了分枝桿菌一定的抗逆性和耐藥性[18-19]。

結(jié)核分枝桿菌通過胞吞作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞，其聚集會(huì)激活巨噬細(xì)胞，使胞內(nèi)酸性逐漸增強(qiáng)，pH值由6.2逐漸下降至5.5[20]。結(jié)核分枝桿菌通過長期的進(jìn)化，對(duì)這種酸性環(huán)境產(chǎn)生了一定的耐受性，其耐酸的能力被認(rèn)為與結(jié)核分枝桿菌的毒力存在關(guān)聯(lián)[21-22]。細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rv3425可以增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，由于恥垢分枝桿菌的毒力較小，試驗(yàn)選取遺傳背景為近交系、免疫能力較差的BALB/c雄性小鼠，通過尾靜脈注射的方式進(jìn)行感染。小鼠的生存曲線、各臟器載菌量以及臟器病變程度結(jié)果顯示，外源轉(zhuǎn)入Rv3425可增強(qiáng)恥垢分枝桿菌的毒力。

因此，從本研究結(jié)果推測，外源轉(zhuǎn)入的Rv3425可能是通過改變分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或脂質(zhì)組分影響其菌落形態(tài)和生物膜等表型，并降低細(xì)胞壁的通透性，從而提高細(xì)菌的抗逆性和抗藥性。后續(xù)還需通過薄層色譜分析(thin layer chromatography，TLC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對(duì)細(xì)菌脂質(zhì)、脂肪酸進(jìn)行更為詳細(xì)的分析以揭示有關(guān)機(jī)制。希望通過深入研究Rv3425的功能及相關(guān)機(jī)制為其應(yīng)用于結(jié)核病的免疫學(xué)診斷及疫苗構(gòu)建提供理論依據(jù)。

A: Colony-forming units of infected THP-1 cells at 0 h, 6 h, 18 h, 24 h. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001. B: Survival curve of infected mice. C: Colony-forming units determined in lysates of lung, spleen, and liver from infected mice. D: From left to right, hematoxylin-stained spleen, lung, and liver sections of infected mice.