一種有效敲低原代B細胞中目的基因表達以快速鑒定基因功能方法的建立

劉佳，萬思敏，白露，李建華

復旦大學上海醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學系, 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032

B細胞免疫應答產生的抗體對于人類多種急、慢性病毒(如新型冠狀病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒等)感染的病原清除及持續(xù)保護至關重要[1-3]，應答過程涉及眾多基因的差異表達，但這些基因如何在其中起作用仍不完全清楚[4]。通過構建基因敲除小鼠鑒定基因功能的經典方法耗時、耗力，無法快速確立相關功能，而在體外B細胞系水平的研究又不能完全代表其在體內正常免疫反應中的功能[5-6]，因此，建立一種體外有效敲低原代B細胞中目的基因表達并通過過繼轉移至小鼠體內鑒定基因功能的方法具有重要意義。目前已有較為成熟的基于反轉錄病毒感染的T細胞轉導方法[7-9]，經單次感染即可達到60%～65%的轉導效率[8]，但缺乏一種高效轉導B細胞以敲低目的基因并進一步回輸體內觀察其增殖和分化情況的方法[10-11]。究其原因，主要存在以下幾個方面的問題：①表達短發(fā)夾核糖核酸(short hairpin RNA，shRNA)的反轉錄病毒滴度較低，導致B細胞的感染率較低；②缺乏既能增殖B細胞，又能維持B細胞自身屬性的體外培養(yǎng)系統(tǒng)；③懸浮的原代B細胞不易被病毒感染；④經體外轉導后的B細胞，過繼轉移到小鼠體內后較難收獲足夠多的增殖和分化的B細胞以供表型分析。

為此，本研究基于pLMpd-Ametrine載體和plat-E細胞包裝系統(tǒng)，通過共轉染Drosha酶特異性小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，增加反轉錄病毒RNA穩(wěn)定性來提高病毒滴度。使用抗CD180抗體(α-CD180)增殖原代B細胞，在B細胞處于活躍的增殖活化狀態(tài)下經2次離心感染(spin infection)轉導反轉錄病毒，使B細胞可獲得超過30%的轉導效率。最后，利用上述優(yōu)化方案，成功敲低并驗證了 B細胞功能基因Bcl6的抗凋亡功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、載體及細胞水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)由本室保存，其誘導的體液免疫應答在病毒感染的清除中起重要作用，是一種被廣泛應用于抗病毒體液免疫研究的模式病毒。使用Vero細胞擴增，用BHK21細胞做空斑形成實驗，測定滴度后于-80 ℃保存[12]。反轉錄病毒包裝載體pLMpd-Ametrine(加利福尼亞大學Jason Cyster教授惠贈)攜帶Ametrine標簽，可直接用流式細胞儀進行檢測[13-14]。plat-E細胞(南京醫(yī)科大學王曉明教授惠贈)基于293T細胞構建，通過EF1α啟動子啟動病毒結構基因gag-pol和env的表達，可穩(wěn)定、高效產生反轉錄病毒[15]。pLMpd-Ametrine載體經plat-E細胞包裝產生攜帶特定基因片段的反轉錄病毒。NIH/3T3細胞由復旦大學鄧強教授惠贈。

1.1.2 實驗小鼠VSV特異性B細胞(VI10 B)取自VI10YEN小鼠(圣拉斐爾科學研究所Matteo Iannacone教授惠贈)。VI10YEN小鼠攜帶轉基因的輕鏈和基因敲入的重鏈，使B細胞可特異性識別VSV并對其產生應答，在抗病毒體液免疫反應的研究中得到了廣泛的應用[16-18]，飼養(yǎng)在復旦大學實驗動物中心。C57BL/6小鼠(SPF級)購自上海靈暢生物科技有限公司。 小鼠6～12周齡，實驗設計符合復旦大學實驗動物倫理要求。

1.1.3 主要試劑DMEM細胞培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Corning公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Biological Industries公司，PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自Takara公司，B細胞陰性選擇試劑盒購自Biolegend公司，轉染試劑Lipofectamine 2000和CD180抗體購自Thermo Scientific公司，流式抗體購自Biolegend和eBioscience公司，Bcl6(D412V)XP兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司。

B細胞培養(yǎng)基配方：RPMI 1640、FBS(10%)、非必需氨基酸(1∶100)、雙抗(Pen/Strep，100 IU/100 μg/mL)、β-巰基乙醇(55 μM)、丙酮酸(1 mmol/L)、谷氨酸(2 mmol/L)、羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid，HEPES)緩沖液(10 mmol/L)。

流式細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)緩沖液為含2%FBS的PBS。

1.2 方法

1.2.1 反轉錄病毒載體的構建Bcl6是一種轉錄抑制蛋白，在B細胞生發(fā)中心反應中高表達，可通過抑制p53腫瘤抑制基因的表達，調節(jié)生發(fā)中心B細胞中DNA損傷誘導的凋亡反應[19]。因此，選擇了已被證明有敲低效率的Bcl6shRNA對系統(tǒng)進行驗證[20]，以靶向海腎熒光素酶(RenillaLuciferase，ren.713)的shRNA作為無關shRNA對照。靶向Ren.713和Bcl6的shRNA寡核苷酸[20-21]序列如下。

Ren.713：

CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACA-GTGAGCGCAGGAATTATAATGCTTATCTA-TAGTGAAGCCACAGATGTATAGATAAGC-ATTATAATTCCTATGCCTACTGCCTCGGA-ATTC

Bcl6-1：

TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGCAAGT-CCCTAATGAGTATATAGTGAAGCCACAGA-TGTATATACTCATTAGGGACTTGCCTTGC-CTACTGCCTCGGA

Bcl6-2：

TGCTGTTGACAGTGAGCGGCTGTCAA-AGAGAAGGCTTTATAGTGAAGCCACAGAT-GTATAAAGCCTTCTCTTTGACAGCTGCCTA-CTGCCTCGGA

以上寡核苷酸經生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，用5′primer：5′-CAGAAGGC-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGA-GCG-3′，3′primer：5′-CTAAAGTAGCCCCTT-GAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3′擴增寡核苷酸[22]，聚合酶鏈反應(PCR)產物膠回收后用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連入pLMpd-Ametrine質粒，通過測序進行驗證。經3T3/NIH細胞篩選得到以上2個有效的Bcl6 shRNA，B細胞轉導相關實驗展示數據由Bcl6 shRNA-1完成。

1.2.2 轉染plat-E細胞產生病毒plat-E細胞鋪板后至匯合度約為80%時，用lipo 2000轉染pLMpd-Ametrine質粒。因細胞內自身存在降解shRNA的Drosha酶，轉錄形成的含有miR-shRNA的病毒會被內源性Drosha酶剪切，進而導致能夠包裝成病毒的shRNA數目減少，因此共同轉染Drosha的siRNA可提高plat-E細胞內病毒RNA的穩(wěn)定性[23-24]，從而增加B細胞的轉導效率。后續(xù)實驗使用摸索得到的最佳濃度siRNA Drosha與pLMpd-Ametrine質粒共轉染。轉染8 h后，更換培養(yǎng)液。分別在更換培養(yǎng)液后的24 h和48 h收集病毒上清液，添加HEPES(終濃度10 mmol/L)和聚凝胺(polybrene)(終濃度5 μg/mL)。

1.2.3 B細胞培養(yǎng)轉染當天，在無菌條件下取含CD45.1/2的VI10YEN小鼠脾臟，陰性選擇B細胞，調整細胞濃度至1×106/ml，加入CD180抗體(1∶4 000)置于37 ℃培養(yǎng)。

1.2.4 B細胞轉導經CD180抗體活化的VI10 B 細胞無剎車離心5 min，去除培養(yǎng)液后加入由plat-E細胞包裝得到的新鮮反轉錄病毒，混勻后室溫無剎車模式 2 450 rpm(1 100×g)離心90 min。離心結束后吸去病毒上清液，用含CD180抗體的B細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第1次離心感染后24 h，再次收集反轉錄病毒上清液，重復離心感染一次。

1.2.5 小鼠VSV感染在第1次離心感染當天，給將要接受過繼轉移VI10 B細胞的C57BL/6小鼠(CD45.2)尾靜脈注射VSV，每只2×106pfu(plaque forming unit, PFU)。

1.2.6 轉導B細胞過繼轉移至C57BL/6小鼠將1.2.4中離心感染2次后的VI10 B細胞用RPMI 1640洗滌、重懸并經小鼠眼眶下靜脈注射過繼轉移(adoptive transfer)至1.2.5中預先感染VSV的C57BL/6小鼠。

1.2.7 轉導B細胞增殖、分化情況的檢測體外觀察刺激劑對B細胞的影響，陰性選擇后的B細胞直接加相應刺激劑培養(yǎng)至指定時間后流式細胞染色即可，涉及的染色抗體：anti-CD80_APC、anti-CD86_BV605 和anti-CD138_PE。對于體內增殖的轉導B細胞，在過繼轉移后相應天數處死小鼠取脾制備單細胞懸液，按以下配色方式進行細胞表面染色：anti-GL-7_PE、anti-B220_PerCP-Cy5.5、anti-FAS_APC、APC-eFluor 780、anti-CD45.1_Pacific Blue，以上抗體均為1∶200加入(APC-eFluor 780以1∶1 000 加入)，冰上孵育40 min，FACS 緩沖液洗滌2次后，使用流式細胞儀Attune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific)進行檢測。

1.2.8 統(tǒng)計學方法與作圖流式細胞儀數據用FlowJ_V10軟件分析，免疫印跡試驗(Western Blot)數據用Image J進行灰度分析。以上數據均使用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計整理。組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本研究將攜帶shRNA的片段克隆進pLMPd-Ametrine質粒后轉染plat-E細胞，獲得反轉錄病毒。用病毒上清液對VSV特異性B細胞進行2次離心感染，最終可獲得30%以上的轉導效率。這些B細胞過繼轉移至預先感染VSV的小鼠后可強烈增殖和分化。轉導靶向B細胞分化過程中重要抗凋亡轉錄因子Bcl6的shRNA導致分化過程中轉導B細胞數量減少。

2.1 CD180抗體能刺激原代B細胞大量增殖并維持其自身屬性

B細胞增殖后在體外進行轉導，然后過繼轉移到小鼠體內再分化，是鑒定目的基因功能的理想方法。但是目前很多體外培養(yǎng)系統(tǒng)在刺激B細胞增殖的同時，也會使B細胞進一步分化為漿細胞[10]。CD180為Toll樣蛋白[25]，本研究發(fā)現CD180抗體刺激可使B細胞相同程度地形成集落增殖灶(結果未顯示)，且活化標志物CD80、CD86的表達顯著高于未接受刺激的B細胞(圖1A)；盡管經脂多糖(LPS)刺激的B細胞能被激活并增殖(圖1A)，但是約有30% 的CD138表達陽性，即分化為漿細胞，而α-CD180激活的B細胞則未見明顯分化(圖1B)。因此，本研究通過CD180抗體刺激成功構建了原代B細胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，在這一培養(yǎng)系統(tǒng)中B細胞可在維持B細胞自身屬性的情況下強烈增殖。

2.2 干擾 Drosha的表達能顯著提高反轉錄病毒的產生

制備高滴度的反轉錄病毒是高效轉導的前提[26]。包裝shRNA的反轉錄病毒轉錄后產生的RNA因攜帶發(fā)卡結構而易被plat-E包裝細胞中的Drosha酶切割，使得病毒滴度極大降低[24]。為消除細胞內Drosha酶對反轉錄病毒RNA穩(wěn)定性的影響，在轉染pLMpd-Ametrine的同時，共轉染了不同濃度的Drosha酶特異性siRNA，濃度在10～100 pmol均可有效敲低plat-E細胞中Drosha酶的表達(圖2A)。進一步將由共轉染Drosha酶特異性siRNA所獲得的反轉錄病毒感染B細胞，發(fā)現共轉染 20 pmol Drosha酶特異性siRNA可使B細胞獲得較高的感染效率(圖2B、C)。因此，通過在病毒包裝細胞中干擾Drosha酶的表達解決了表達shRNA的反轉錄病毒滴度較低的問題。

2.3 2次離心感染可顯著提升B細胞的轉導效率

與原代T細胞相比，B細胞在體外很難被病毒有效轉導。T細胞在體外單次離心感染即可獲得30%以上的感染效率[8]，而原代B細胞單次感染效率非常低。本研究嘗試重復離心感染以提高B細胞的感染效率，結果發(fā)現重復離心感染使B細胞轉導效率在共轉Drosha酶特異性siRNA的基礎上約增加1倍，即從現有的5%～15%提高到30%以上(圖3)。

A: Relative expression of B-cell surface markers (CD80 and CD86) on B cells following cultured 24 h with α-CD180 or LPS. B: Relative expression of plasma cell surface markers (CD138) of cultured B cells following cultured 72 h with α-CD180 or LPS (Gray: Naive B cell. Blue: Stimulated with LPS. Red: Stimulated with α-CD180).

A: Efficiency of Drosha specific siRNA was detected by Western Blot in plat E cells. B and C: Transduction efficiency of B cells using retrovirus packaged without or with gradient concentration of Drosha specific siRNA during transfection. Transduced B cell showed as Ametrine+.

Transduced B cell showed as Ametrine+.

2.4 受體鼠預感染可顯著提高過繼轉移后B細胞收獲的數量

VI10小鼠繁殖較為困難，因此B細胞體外轉導后，如何盡可能少地過繼轉移B細胞是提升實驗效率的關鍵環(huán)節(jié)[27]。VI10YEN小鼠的B細胞特異性識別VSV抗原，過繼轉移至野生型受體小鼠后，可在VSV感染時強烈增殖和分化，最終產生特異性抗體[28]。以往研究都是在過繼轉移的同時或之后用VSV感染受體鼠，考慮到B細胞增殖和分化是一個連續(xù)的過程，本實驗嘗試在VSV預先感染受體鼠后再過繼轉移病毒轉導的B細胞。如圖4所示，在過繼轉移前預先感染VSV的小鼠(pre-infection)脾臟中，可檢測到的VI10YEN B細胞數量持續(xù)高于過繼轉移同時感染(syn-infection)的小鼠。因此，受體鼠預感染可收獲更多增殖、分化的B細胞以供后續(xù)表型分析，如此極大節(jié)省了實驗材料并減輕了工作量。

2.5 通過敲低B細胞目的基因表達確定基因功能方法的驗證

經過以上環(huán)節(jié)的優(yōu)化，用NIH/3T3細胞在體外篩選得到了2個有效敲低B細胞抗凋亡分子Bcl6的shRNA(圖5A)。使用相同方法轉導B細胞后將其過繼轉移至受體鼠，6 d后進行檢測，實驗流程如圖5B。發(fā)現過繼轉移前后，轉導Bcl6 shRNA 的VI10YEN B細胞(Ametrine陽性)與對照shRNA相比在總過繼轉移的B細胞中占比稍有下降，但在免疫6 d后，其比例下降尤其顯著(圖5C)，3次實驗結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(圖5D)。這一結果與之前報道的Bcl6在B細胞分化過程中抗凋亡的作用相一致[19]。

A: VI10 B cells (CD45.1/2) were transferred to pre-infected mice(Pre-infection) or to mice infect VSV simultaneously (Syn-infection). Detect the CD45.1/2 cells at different time points. B: The proportion and total number of CD45.1/2 cells in all lymphocytes (100,000 total) are shown in (B) and (C), respectively.

3 討論

為探究抗病毒體液免疫反應中眾多未被闡明的基因功能，本研究構建了一種通過反轉錄病毒轉導的shRNA對原代B細胞進行功能基因敲低的方法。通過共轉染Drosha酶特異性siRNA制備攜帶shRNA的反轉錄病毒，2次離心感染CD180抗體激活的VSV特異性原代B細胞，最終可獲得約30%的轉導效率。這些轉導細胞在過繼轉移至預先使用VSV感染的C57BL/6小鼠后可在體內增殖、分化并表現出目的基因敲低的表型。

本研究提供的原代B細胞轉導方法相較之前的研究有以下幾個方面的改進。①為提高含有shRNA的反轉錄病毒RNA的穩(wěn)定性，在包裝病毒時共轉染了Drosha酶特異性siRNA，這可以顯著提高B細胞的轉導效率。②對維持B細胞增殖活化的刺激劑進行了改進。B細胞只有在增殖的情況下才能被反轉錄病毒感染，目前激活B細胞的方式有LPS、IL4+CD40L、anti-IgM F(ab) BCR 交聯(lián)以及CD180抗體與B細胞共培養(yǎng)[10]，但只有CD180抗體是較為合適的刺激劑[25]，它可以在體外通過Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)4有效激活B細胞并維持B細胞存活，但不使其分化為漿細胞，適用于體外激活原代B細胞；值得注意的是，高營養(yǎng)的培養(yǎng)基也對原代B細胞增殖至關重要[29]。③對B細胞而言，離心感染2次可顯著提高其轉導效率。④為保持B細胞在體內最大的增殖能力，對VSV感染小鼠和過繼轉移細胞的先后次序進行了探究。結果表明，預先免疫可使過繼轉移的B細胞有更強烈的增殖，也可獲得更多數量的轉導B細胞以供分析。這可能是由于預先感染VSV可激活體內其他輔助細胞，如CD4+T細胞等，為B細胞的增殖和分化提供了必要的輔助因子。

綜上所述，通過對以上步驟的改良，系統(tǒng)地建立了一種有效敲低原代B細胞中目的基因表達以快速鑒定基因功能的方法。該方法可用于B細胞增殖、分化過程中基因功能的鑒定，也可作為較大規(guī)?；蚯贸∈髽嫿ㄇ肮δ芑虻某醪胶Y選，為研究病毒感染中B細胞的增殖、分化機制及其存在的缺陷打下了良好基礎。

A: Expression of Bcl6 in transduced NIH/3T3 cells was detected by Western Blot **：P<0.001. B: Schematic diagram of the experiment. C: Analysis of transduced cells proportion before and after adoptive transfer. D: Proportion of Bcl6 shRNA-transduced cells relative to Ren.713 shRNA-transduced cells. *：P<0.05