冠狀病毒疫苗的研究進展

崔文禹，徐靜

國藥中生生物技術研究院有限公司，北京 101111

冠狀病毒是一組有包膜的單鏈RNA 病毒，在系統(tǒng)分類中屬巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)[1]。冠狀病毒直徑約80～120 nm，基因組5′端具有甲基化的帽狀結構，3′端具有poly(A)尾，基因組全長約27～32 kb，是已知RNA病毒中基因組最大的病毒。根據(jù)血清學和基因組特點，冠狀病毒科被分為4 個屬(α、β、γ和δ)，其中只有α和β屬含有對人致病的毒株。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種可感染人類的冠狀病毒分別是人冠狀病毒229E(human coronavirus 229E, HCoV-229E)、人冠狀病毒OC43 (human coronavirus OC43, HCoV-OC43)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)、人冠狀病毒NL63 (human coronavirus NL63, HCoV-NL63)、人冠狀病毒HKU1 (human coronavirus HKU1, HCoV-HKU1)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。其中4種流行的“普通”人冠狀病毒，即HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，主要引起輕度自限性上呼吸道疾病[2]。而SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2屬于高致病性冠狀病毒，可引起嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，致死率高，對人類健康構成嚴重威脅。由于目前對該類高致病性病毒引起的感染無特異性預防措施和治療方法，因此研制高致病性冠狀病毒疫苗具有重要的意義。

隨著SARS-CoV-2感染人數(shù)不斷攀升，研制針對該病毒的有效疫苗成為近期的研究熱點。本文以高致病性冠狀病毒疫苗(包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、重組病毒載體疫苗和核酸疫苗)的研究展開綜述。

1 冠狀病毒的生物學性狀

冠狀病毒基因組序列比對顯示，整個基因組的同源性為54%，其中非結構蛋白編碼區(qū)同源性為58%，結構蛋白編碼區(qū)同源性為43%，這表明非結構蛋白基因保守，而結構蛋白基因呈多樣化[3]。SARS-CoV-2基因組(GenBank:MN975262)全長 29 891 bp，編碼 9 860 個氨基酸，與2018年在中國東部舟山采集的源于蝙蝠的2種與SARS類似的冠狀病毒bat-SL-CoV ZC45和bat-SL-CoV ZXC21同源性為88%，與SARS-CoV、MERS-CoV同源性分別為79%、50%[4]。

冠狀病毒表面的刺突(spike, S)蛋白有重要的生物學功能，參與受體結合和介導病毒與宿主胞膜融合，是誘導中和抗體的主要抗原。SARS-CoV S蛋白中的受體結合域與宿主的血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)結合，進而介導病毒進入宿主細胞。SARS-CoV的S1結構域(318-510AA)中的193個氨基酸片段已被確定為最小受體結合結構域(receptor binding domain, RBD)，足以與ACE2結合[5]。MERS-CoV與SARS-CoV的受體不同，其在人類細胞上的受體是二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)，也稱為CD26。MERS-CoV通過表面S蛋白與DPP4結合，進而攻擊人體細胞[6]。SARS-CoV-2受體結合域與SARS-CoV受體結合域非常相似。Wrapp等[7]確定了預融合構象中SARS-CoV-2的S蛋白三聚體冷凍電鏡結構。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2利用高度糖基化的同源三聚體S蛋白進入宿主細胞，SARS-CoV-2與ACE2的親和力為SARS-CoV的10～20倍。

2 冠狀病毒疫苗的類型

接種疫苗是控制和預防傳染病最經(jīng)濟、最有效的手段，但迄今為止還沒有針對冠狀病毒的商品化疫苗。目前針對SARS-CoV與MERS-CoV的疫苗研發(fā)主要包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、重組病毒載體疫苗和核酸疫苗等種類。

2.1 滅活疫苗

將冠狀病毒用物理或化學方法滅活，使其喪失毒力，但仍保留免疫原性。這樣制成的疫苗具有許多優(yōu)勢，包括相對較低的生產成本和良好的安全性。用甲醛、紫外線或丙內酯滅活的SARS-CoV可在動物模型中誘導SARS中和抗體的產生[8]。中國已開發(fā)以滅活SARS-CoV為主的SARS候選疫苗，這是全球第一個進入臨床試驗的SARS 疫苗[9]。受試者一共接受了2劑SARS-CoV滅活疫苗。第1次接種42 d后，疫苗組的血清轉化率達到100%。第2次疫苗接種后2周，中和抗體效價達到峰值，但4周后效價開始下降。該SARS-CoV滅活疫苗安全性良好，可誘導SARS-CoV特異性中和抗體的產生[10]。Tan等[11]用滅活的MERS-CoV與佐劑(鋁和CpG寡脫氧核苷酸)配伍，在人DPP4轉基因小鼠模型中可有效誘導產生針對MERS-CoV的保護性免疫應答。盡管滅活疫苗具有一定的保護作用，但需要注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)接種MERS-CoV滅活疫苗能誘導出中和抗體并降低人DPP4轉基因小鼠的病毒載量，但再經(jīng)MERS-CoV攻擊時，可能引起機體的超敏反應型肺免疫病理反應[12]。此外，在制備SARS滅活疫苗時，處理高濃度的活病毒可能會對生產工人構成風險，且病毒的不完全滅活可能會在接種人群中引發(fā)SARS[13]。

2.2 重組亞單位疫苗

亞單位疫苗盡管免疫原性低，但相對其他疫苗而言具有較高的安全性。 S蛋白是冠狀病毒與宿主細胞表面受體結合，進而介導病毒感染宿主細胞的關鍵蛋白。因此，大多數(shù)候選疫苗基于全長或部分截短的S蛋白進行重組構建，由S蛋白誘導的中和抗體在機體對抗致命冠狀病毒時提供保護作用[14]。天然S蛋白以三聚體的形式存在，研究人員將MERS-CoV S蛋白與foldon結構域融合表達，使其自發(fā)形成三聚體結構，該蛋白在BALB/c小鼠中誘導出高效價中和抗體[15]。Zhou等[16]基于foldon結構域融合表達了RBD三聚體，并證明該疫苗對表達人DPP4轉基因小鼠在受MERS-CoV攻擊時有保護作用(存活率為83%)。RBD與人IgG Fc片段融合表達(RBD-Fc)的疫苗，可誘導小鼠的體液免疫和細胞免疫應答。Hotez等[17]應用中國倉鼠卵巢細胞穩(wěn)定表達RBD蛋白，RBD蛋白經(jīng)純化后與MF59佐劑配伍，肌內注射到表達人DPP4的轉基因小鼠后可在MERS-CoV攻擊時產生保護作用，且沒有免疫毒性或嗜酸性粒細胞免疫增強的證據(jù)。在恒河猴模型中，RBD(S367-606)與氫氧化鋁佐劑配伍，與低劑量組相比，用高劑量組免疫的動物在受到MERS-CoV攻擊后,肺炎嚴重程度減輕，同時病毒載量減少[18]。

除了將全長S蛋白和RBD作為亞單位疫苗的研究靶點外，也有研究者將S1蛋白N端結構域(N-terminal domain, NTD)作為疫苗新的靶點。S1的NTD不包含RBD，NTD可與細胞表面的病毒受體唾液酸結合，因此NTD是病毒感染宿主細胞的關鍵。Tan等[19]應用S蛋白的NTD作為另一種亞單位疫苗，免疫BALB/c小鼠后，在MERS-CoV攻擊時可誘導中和抗體產生并減少小鼠的呼吸道病理反應。Hu等[20]基于免疫表位設計疫苗，發(fā)現(xiàn)高度保守的區(qū)域可以誘導產生中和抗體和針對MERS-CoV的細胞免疫。根據(jù)計算機對病毒蛋白抗原表位和結構的預測和分析，MERS-CoV的核衣殼(nucleocapsid, N)蛋白可能是一種更好的保護性免疫原，具有較高的保守性并可誘導中和抗體的產生和細胞免疫應答。

病毒樣顆粒(virus like particle ,VLP)是由病毒衣殼結構蛋白組成的、具有類似天然病毒顆?？臻g結構的多聚體，同時不含有傳染性遺傳物質，即無復制性和感染性。VLP能展示病毒的不同表位，從而產生嵌合VLP(chimeric VLP，cVLP)。Xia等[21]構建的cVLP表面展示MERS-CoV受體結合域，可誘導產生RBD特異性中和抗體和細胞免疫應答。另外，冠狀病毒中N蛋白和S蛋白的S2結構域相對保守，針對不同的冠狀病毒有可能提供更廣泛的保護[22]。

2.3 重組病毒載體疫苗

在減毒的病毒基因組中插入含有一種或多種外源保護性抗原基因獲得的重組病毒，免疫機體后表達出相應的目的蛋白，從而誘導免疫應答，這類疫苗稱為重組病毒載體疫苗。為了達到有效保護，冠狀病毒疫苗不僅應引起體液應答，而且還應引起特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞應答。作為載體的痘病毒、腺病毒、麻疹病毒等已用于冠狀病毒疫苗的開發(fā)。

2.3.1 痘病毒載體痘病毒具有基因組穩(wěn)定性好、容量大、含多個非必需區(qū)基因、可被允許插入多個外源基因等優(yōu)點。應用改良安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia Ankara virus, MVA)，表達不同長度的S蛋白片段(全長S、S1或RBD)，都誘導出了針對MERS-CoV的中和抗體和T細胞應答。Sutter等[23]應用修飾的MVA構建了針對MERS-CoV的病毒載體疫苗，其誘導的MERS-CoV特異性CD8+T細胞應答和中和抗體，能夠保護表達人DPP4的小鼠免受MERS-CoV的攻擊。

2.3.2 腺病毒載體腺病毒基因組大小適中，宿主范圍廣，對人致病性低，對于分裂和非分裂細胞均具有高轉導效率。Tan等[24]應用2種重組腺病毒〔adenoviral type 5 (Ad5) 和type 41 (Ad41)〕編碼MERS-CoV S蛋白，評估了單次肌內注射或灌胃給藥腺病毒載體S蛋白(Ad-S)誘導的特異性免疫應答。灌胃給藥Ad5-S或Ad41-S可誘導出特異性中和抗體；然而，未檢測到特異性細胞免疫應答。單次肌內注射Ad5-S或Ad41-S，可誘導出中和抗體及細胞免疫反應。由于人群中普遍存在針對常見的人血清型腺病毒的中和抗體，影響了相應腺病毒載體在臨床中的應用。采用黑猩猩型腺病毒(ChAdOx1)作為病毒載體，是基于ChAdOx1編碼MERS-CoV S蛋白的疫苗可誘導出高水平中和抗體和特異性CD8+T細胞免疫應答[25]。ChAdOx1-S具有較高的免疫原性，單劑量鼻內或肌內注射表達人DPP4轉基因小鼠，可抵御致命的MERS-CoV攻擊[26]。

2.3.3 麻疹病毒載體在易感麻疹病毒(measles virus, MV)的小鼠中，表達全長S蛋白的重組MV誘導了高效價的中和抗體，使被免疫的動物免受鼻內感染SARS-CoV的攻擊。與S蛋白(鋁佐劑)免疫相比，重組的MV誘導了更強Th1細胞反應[27]。MVvac2-MERS-S(H)經(jīng)紫外線滅活后免疫MV易感小鼠，未檢測到MERS-CoV或MV的免疫應答，只有活的重組疫苗才能引發(fā)免疫反應。同時，編碼MERS-CoV N蛋白的MV可誘導N特異性細胞免疫應答[28]。此外，新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)[29]和水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)[30]作為病毒載體，均能誘導出中和抗體。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)表達抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答。核酸免疫是一個有吸引力的疫苗平臺，可以快速開發(fā)疫苗，且具有較低的生產成本。但核酸疫苗存在病毒的遺傳物質整合入宿主細胞染色體的潛在風險[31]。用編碼SARS-CoV S蛋白的DNA候選疫苗免疫BALB/c小鼠，能誘導產生中和抗體、細胞免疫應答以及保護性免疫應答[32]。pVax1TM(GLS-5300)是首個進入臨床試驗的MERS-CoV DNA候選疫苗。該疫苗基于MERS-CoV保守的S蛋白，抗原經(jīng)過密碼子優(yōu)化后以pGX9101為載體構建 DNA 疫苗，可在小鼠、獼猴和駱駝中誘導出有效的中和抗體和細胞免疫應答[33]。GLS-5300已完成了Ⅰ期臨床試驗[34]，受試者耐受性良好，無疫苗相關的嚴重不良反應。一劑次和兩劑次免疫后受試者血清轉化率分別為66%和86%，第60周時受試者血清轉化率為79%。Graham等[35]改變疫苗接種方案，以肌內注射編碼MERS-CoV S蛋白的全長DNA疫苗作為初次免疫，S1蛋白進行加強免疫，與僅接種S1蛋白相比，接受前一種免疫程序的恒河猴產生了更多的中和抗體，可降低嚴重的肺部病變。編碼MERS-CoV S1基因的DNA疫苗可以誘導體液免疫和細胞免疫應答，在沒有佐劑的情況下產生高效價的中和抗體，接種疫苗后肺部細胞中的病毒載量顯著降低[36]。

3 SARS-CoV-2疫苗的研究

根據(jù)SARS/MERS-CoV疫苗研發(fā)經(jīng)驗，開發(fā)SARS-CoV-2疫苗，以減毒活疫苗、重組亞單位疫苗、重組病毒載體疫苗、核酸疫苗等多條研發(fā)技術路線同步開展，產生了多個平臺的候選疫苗(表1)。在新技術與以往經(jīng)驗的雙重助力下，疫苗的早期研發(fā)工作在研發(fā)人員獲取病毒序列之后的2～3周內就已完成，并迅速進入動物實驗階段。目前在研疫苗共有14個，其中ChAdOx1 nCoV-19、INO-4800和SARS-CoV-2疫苗研究進度較快。

表1 SARS-CoV-2疫苗的在研情況*

4 結語

SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)迫在眉睫，研發(fā)過程中應關注其安全性、免疫原性、免疫持久性等問題。冠狀病毒感染存在抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement, ADE)作用，Altmeyer[37]等證明由SARS-CoV的全長S蛋白誘導的非中和抗體促進病毒通過FcγR依賴性途徑進入宿主細胞，從而增強了病毒的感染性，這引發(fā)了人們對疫苗安全性的擔憂。因此ADE是研制SARS-CoV-2疫苗中應關注的安全性的關鍵問題。

ACE2并非冠狀病毒唯一受體，DC-SIGN和CD209L (L-SIGN)均可充當SARS-CoV的結合受體，促使病毒進入宿主細胞[38]，故而需對ACE2以外的受體加以關注。此外，有SARS-CoV疫苗研究表明，疫苗能夠在幼鼠(6～8周齡)中誘導保護性免疫應答，但不能保護老年鼠(12～14月齡)[39]。因此需要針對疫苗在免疫功能低下和患有慢性疾病的人群及不同年齡群中的有效性進行研究。

對SARS治愈者進行長期隨訪發(fā)現(xiàn)，只有少數(shù)患者在發(fā)病6年后仍可檢測到IgG抗體，存在中和抗體隨時間推移逐漸減弱的現(xiàn)象。SARS-CoV感染后病毒特異性記憶CD8+T細胞持續(xù)存在長達6年，此時無法檢測到記憶B細胞和病毒特異性抗體[40]。綜上所述，有效的SARS-CoV-2疫苗應具有良好的安全性，有誘導體液免疫和細胞免疫應答的能力，同時具有較好的免疫持久性以提供長期的保護。

Lu等[41]對103株SARS-CoV-2全基因組進行了分子進化分析，發(fā)現(xiàn)病毒株已出現(xiàn)了149個突變點，而且多數(shù)是近期產生的。該研究揭示，SARS-CoV-2已經(jīng)演化出L和S 2個亞型，其中101株屬于這2個亞型。從占比上看，L亞型更為普遍，達到70%，S亞型占30%。作者認為L亞型和S亞型的傳播能力、致病嚴重程度或許存在較大區(qū)別，L亞型可能更具侵略性，更易快速擴散。這種變異可能增加了SARS-CoV-2疫苗研制的困難。如果這些病毒亞型暴發(fā)流行，可能會給人們帶來新一輪的挑戰(zhàn)。

除此之外，關于冠狀病毒疫苗的研發(fā)，還有以下幾個問題需要投資者、研發(fā)人員及相關部門關注：①如果SARS-CoV-2像SARS-CoV一樣，在疫情過后從人間消失或毒力減弱，成為普通冠狀病毒，則將無須疫苗預防；②如果下一個類似的流行季再現(xiàn)，國家仍然采取一級響應，疫苗效力的評價則會面臨挑戰(zhàn)；③安慰劑對照試驗是驗證新藥有效性的一個重要且難以替代的方法，但采用安慰劑對照試驗可能會有道德風險。