牛黃對治療腦梗死的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和潛在機(jī)制研究

梁玉華 何花花 鄧太平

[摘要]目的 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測牛黃治療腦梗死的潛在靶點，探討其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用機(jī)制。方法 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)挖掘獲取牛黃的主要活性成分，利用人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards預(yù)測和篩選牛黃活性成分的作用靶點。采用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.1軟件繪制蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，借助DAVID6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行潛在基因的基因本體論（GO）分析。結(jié)果 篩選得到牛黃5個活性成分，涉及3個作用靶點。GO分析結(jié)果顯示，牛黃治療腦梗死的生物過程主要涉及類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、維生素D受體結(jié)合、核受體結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、ATP酶結(jié)合等。結(jié)論 牛黃治療腦梗死是一個多成分、多靶點的復(fù)雜過程，主要通過調(diào)控NR3C2、PGR、RXRA這3個靶點，涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、維生素D受體結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、ATP酶結(jié)合等生物過程而發(fā)揮干預(yù)腦梗死的作用。

[關(guān)鍵詞]網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);牛黃;腦梗死;潛在機(jī)制

[中圖分類號] R282? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）7（a）-0008-04

Study on the regulatory network and potential mechanism of Bezoar in the treatment of cerebral infarction

LIANG Yu-hua1? ?HE Hua-hua2? ?DENG Tai-ping3

1. Department of Pharmacy， Huizhou Municipal Central People′s Hospital， Guangdong Province， Huizhou? ?516001， China; 2. Department of Neurology， Huizhou Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Huizhou? ?516001， China; 3. Department of Internal Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital of Boluo County in Huizhou City， Guangdong Province， Boluo? ?516100， China

[Abstract] Objective To predicit the potential target of Bezoar in the treatment of cerebral infarction via network pharmacology and to explore its regulatory network and mechanism of action. Methods The main active components of Bezoar were were obtained through traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） database and literature mining， and the target of the active ingredients of Bezoar was predicted and screened using the human gene database GeneCards. String database and Cytoscape 3.7.1 software were used to draw protein interaction （PPI） network， and gene ontology （GO） analysis of potential genes was performed with the application of DAVID6.8 database. Results A total of 5 active ingredients of Bezoar were obtained by screening， involving 3 targets. GO analysis results showed that the biological process of Bezoar in the treatment of cerebral infarction mainly involved steroid hormone receptor activity， nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid binding， vitamin D receptor binding， nuclear receptor binding， chromatin DNA binding， and ATPase binding， etc. Conclusion The treatment of cerebral infarction by Bezoar is a complex process with multiple components and multiple targets， mainly by regulating the three targets of NR3C2， PGR and RXRA， involving nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid binding， vitamin D receptor binding， chromatin DNA binding， ATPase binding and other biological processes to play a role in intervening cerebral infarction.

[Key words] Network pharmacology; Bezoar; Cerebral infarction; Potential mechanism

腦梗死是指各種原因引起腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損，又稱缺血性腦卒中[1]，是臨床上常見的一種心腦血管疾病，具有發(fā)病急驟，致死、致殘率高等特點[2]。腦梗死超過48 h病情逐漸惡化、加重，稱為進(jìn)展性腦梗死（progressive cerebral infarction，PCI）[3]。目前臨床主要是采取常規(guī)藥物治療，包括抗凝、溶栓、抗血小板等，但對患者神經(jīng)功能恢復(fù)難以取得較為理想的效果。腦梗死屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其發(fā)病常與風(fēng)、火、痰、虛、瘀等因素相關(guān)?！爸酗L(fēng)”為本虛標(biāo)實、上盛下虛之證，雖有本虛，但標(biāo)實更為突出，應(yīng)以“急則治其標(biāo)”為原則，分別以平肝熄風(fēng)、清熱滌痰、化痰通腑、活血通絡(luò)、醒神開竅等法。目前，中醫(yī)藥在治療腦梗死取得良好的效果，顯示了廣闊的前景。有文獻(xiàn)報道，安宮牛黃丸、體外培育牛黃等牛黃制劑具有明顯改善腦缺血癥狀，減輕腦損傷的作用[4-5]。據(jù)文獻(xiàn)顯示，牛黃有清心解毒、豁痰開竅功能，能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)介質(zhì)兒茶酚胺的活性，從而恢復(fù)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上功能，達(dá)到醒神復(fù)蘇的作用[6]。牛黃（Calculus Bovis）是我國傳統(tǒng)名貴中藥，又名“土精”“丑寶”，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，距今已有兩千多年歷史[7]。牛黃天然來源于哺乳綱偶蹄目牛科脊椎動物牛的膽囊、膽管以及肝管中的結(jié)石，其性涼、味苦，具有清熱解毒、熄風(fēng)止痙、化痰開竅的功效。牛黃在治療熱病神昏、中風(fēng)痰迷等方面均有較好的效果，但其潛在機(jī)制不明確，因此借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選牛黃的活性成分，挖掘牛黃干預(yù)腦梗死的作用靶點以闡明其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1牛黃活性成分的獲取和篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）可以從整體水平研究藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，為揭示中藥性質(zhì)與作用機(jī)制的平臺[8]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取牛黃的化學(xué)成分，輸入關(guān)鍵詞“牛黃”，得到活性成分信息?？诜o藥是中藥制劑最常見的給藥途徑[9]，口服生物利用度（OB）是評價中藥臨床藥效的有效指標(biāo)，是藥物吸收、分布、代謝、排泄的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是決定活性組分類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)。類藥性（DL）>0.18的化合物被認(rèn)為是具有較高的DL并選為候選分子進(jìn)行研究[10]。因此本研究通過OB和DL兩個指標(biāo)對牛黃活性成分進(jìn)行篩選，以O(shè)B>30%和DL>0.18[11]為限定條件，在TCMSP中篩選出符合上述2個條件的成分為牛黃活性較高的的化學(xué)成分。

1.2預(yù)測潛在靶點

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索出牛黃活性成分的作用靶點，作為候選藥物的作用靶點。然后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）將候選藥物靶點轉(zhuǎn)換成基因名稱。以“cerebral infarction”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）搜索與腦梗死相關(guān)的基因。將挖掘到的cerebral infarction相關(guān)基因與藥物的靶點基因映射篩選得出共同基因，從而得到牛黃活性成分治療腦梗死的相關(guān)作用靶標(biāo)。

1.3活性成分-疾病靶點構(gòu)建

將候選化學(xué)成分與cerebral infarction靶點通過Cytoscape 3.7.1建立牛黃的化合物-腦梗死靶點群網(wǎng)絡(luò)，每個節(jié)點（node）是基因、蛋白質(zhì)或分子;節(jié)點與節(jié)點之間的連線（edge）代表著這些生物分子之間的相互作用，根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選出牛黃作用腦梗死的關(guān)鍵化合物。

1.4蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物活性成分-疾病的交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），以構(gòu)建牛黃治療腦梗死PPI網(wǎng)絡(luò)[12]。限定物種為“homo sapiens”（人類），設(shè)定最低相互作用閾值為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持不變，得到蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果保存為TSV格式。使用Cytoscape 3.7.1軟件將活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與腦梗死相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)融合，取交集部分，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5基因本體論（gene ontology，GO）功能分析

GO是用于描述基因產(chǎn)物功能并且廣泛應(yīng)用于生物信息學(xué)領(lǐng)域的一個本體[13]。將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫[14]，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“homo sapiens”，將靶點基因修正為官方名稱（“official gene symbol”），設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行GO生物過程富集分析，結(jié)果用R語言分析作圖。

2結(jié)果

2.1牛黃活性成分及靶點的篩選

TCMSP中以O(shè)B%>30，DL>0.18為篩選條件獲得5個牛黃活性成分，結(jié)果見表1。逐一對應(yīng)靶點，得到牛黃活性成分靶點133個。

2.2疾病潛在靶點獲取結(jié)果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到2611個腦梗死相關(guān)靶點基因。

2.3網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果

將牛黃活性成分對應(yīng)靶點與腦梗死相關(guān)作用靶點取交集得到活性成分-疾病靶點基因3個，對應(yīng)牛黃5個活性成分。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，具體見圖1（封三）。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

將映射得到的靶點基因輸入String數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2（封三）所示。PPI網(wǎng)絡(luò)包括了3個靶蛋白節(jié)點，共有3條邊代表了蛋白之間的相互作用，處于該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中心的蛋白質(zhì)有NR3C2、PGR、RXRA，可能是牛黃干預(yù)腦梗死的重要靶點。

2.5 GO功能分析

3個藥物活性成分-疾病交集基因影響了19個生物學(xué)過程（P<0.05）（表2、圖3，封三）。結(jié)果顯示，牛黃的活性成分主要富集在類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、維生素D受體結(jié)合、類維生素A結(jié)合、類異戊二烯結(jié)合、一元羧酸結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、ATP酶結(jié)合等方面。

3討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，進(jìn)行“疾病-基因-藥物”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從整體的角度去探討藥物與疾病的相關(guān)性，因此本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對牛黃干預(yù)腦梗死的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探討。本次研究收集到與牛黃干預(yù)腦梗死的相關(guān)活性成分有脫氧膽酸甲酯（Methyl desoxycholate）、Deoxycholic Acid、ZINC01280365、CLR等。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫得到2611個腦梗死的相關(guān)靶點，通過映射找到了NR3C2、PGR、RXRA這3個牛黃干預(yù)腦梗死的潛在治療靶點。同時利用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些靶蛋白之間存在著相互聯(lián)系，由此推測靶點之間的相互調(diào)節(jié)可能是牛黃治療腦梗死的潛在機(jī)制。進(jìn)一步提煉牛黃干預(yù)腦梗死的生物學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)其靶點主要富集在類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、維生素D受體結(jié)合、核受體結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、ATP酶結(jié)合等生物學(xué)過程，這與腦梗死的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。

有研究表明，Na+-K+-ATP酶活性對神經(jīng)元損傷起到關(guān)鍵的作用[15]，Na+-K+-ATP酶活性的降低會加重腦組織水腫程度，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致腦梗死面積擴(kuò)大，從而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[16]。因此，從本次GO功能分析研究結(jié)果推測牛黃的活性成分可能通過保護(hù)并提高ATP酶結(jié)合活性，以減輕腦水腫和減少神經(jīng)元凋亡，從而起到干預(yù)腦梗死的作用。目前，牛黃活性成分通過何種途徑增加Na+-K+-ATP酶活性尚不明確，還需要進(jìn)一步的研究探討。另有研究顯示，維生素D水平低下與腦梗死發(fā)病、進(jìn)展以及不良預(yù)后發(fā)生率有密切的相關(guān)性[17-18]。亦有研究表明，維生素D可通過多種途徑對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，主要能釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子以及免疫調(diào)節(jié)減弱炎癥反應(yīng)來保護(hù)神經(jīng)[19]，亦可抑制PAI-1等凝血因子來抑制血栓形成，改善腦梗死的嚴(yán)重程度，避免神經(jīng)功能進(jìn)一步損傷[20]。由此推測在其參與的生物功能過程中，牛黃活性成分可能通過干預(yù)維生素D受體結(jié)合活性，起到神經(jīng)保護(hù)和抗氧化效應(yīng)的作用，從而干預(yù)腦梗死的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，通過成分、靶點、生物過程的作用網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)牛黃的作用也是多靶點多途徑的過程，說明牛黃作用機(jī)體不是單一的，有可能是復(fù)雜、系統(tǒng)的作用，符合腦梗死病理生理復(fù)雜的發(fā)展過程，但由于數(shù)據(jù)庫信息不完全，有些化合物可能會被忽略，一些活性成分可能會在篩選過程中被遺漏，關(guān)鍵基因的提取也是基于一定的算法，有一定的局限性，篩選出的關(guān)鍵基因以及具有預(yù)測作用的基因均需要進(jìn)一步試驗驗證。

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（收稿日期：2020-03-05）