烏頭堿皮膚微透析體外回收率的測定及其影響因素研究

郭麗蓉 徐松 李娜

[摘要]目的 考察烏頭堿皮膚微透析體外回收率的影響因素。方法 分別采用增量法、減量法考察灌流液流速、烏頭堿濃度及環(huán)境溫度對(duì)微透析體外回收率的影響。結(jié)果 灌流液流速越高，微透析體外回收率越低;烏頭堿濃度對(duì)微透析體外回收率的影響較小;環(huán)境溫度越高，微透析體外回收率也越高。結(jié)論 烏頭堿皮膚微透析體外回收率受灌流液流速及環(huán)境溫度影響，與烏頭堿濃度無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]烏頭堿;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;微透析;回收率

[中圖分類號(hào)] R651.15? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）7（a）-0012-05

Determination of recovery rate of Aconitine skin microdialysis in vitro and study on its influencing factors

GUO Li-rong? ?XU Song? ?LI Na

Yunnan Institute of Materia Medica， Yunnan Baiyao Group Innovation and R&D Center， Yunnan Province Company Key Laboratory for Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming? ?650111， China

[Abstract] Objective To investigate experimental factors affecting recovery rate of Aconitine skin microdialysis in vitro. Methods The effect of persuate flow rate， Aconitine concentration and ambient temperature on the recovery rate of microdialysis in vitro was investigated by gain method and loss method. Results The recovery rate of microdialysis in vitro decreased with the increasing of perfusate flow rate. The Aconitine concentration has little effect on the recovery rate of microdialysis in vitro. The higher the ambient temperature， the higher the recovery rate of microdialysis in vitro. Conclusion The recovery rate of Aconitine skin microdialysis in vitro is affected by the perfusate flow rate and ambient temperature， and not affected aconitine concentration.

[Key words] Aconitine; Liquid chromatography-mass spectrometry; Microdialysis; Recovery rate

烏頭堿是毛茛科烏頭屬植物中普遍含有的雙酯型生物堿，其具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性[1]，對(duì)中樞和外周疼痛都有抑制作用[2]，同時(shí)也是強(qiáng)毒性成分[3]，人口服0.2 mg即出現(xiàn)中毒癥狀[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，烏頭堿能夠?qū)е聡?yán)重的心臟毒性[6-8]。烏頭堿可以通過皮膚被吸收，研究表明，烏頭堿經(jīng)皮給藥后可以提高用藥安全性，并維持較長作用時(shí)間[9]。微透析技術(shù)是一種以透析原理為基礎(chǔ)的膜取樣技術(shù)，其可以對(duì)生物體進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)、在線取樣，具有不影響動(dòng)物體液量、減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量、降低個(gè)體差異等特點(diǎn)[10]，近年來已應(yīng)用于生物化學(xué)、藥理學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥動(dòng)學(xué)等領(lǐng)域中[11-16]。為了建立將微透析技術(shù)應(yīng)用于烏頭堿的透皮藥動(dòng)學(xué)研究的方法，本研究對(duì)微透析體外回收率的影響因素進(jìn)行考察。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

島津LCMS8030液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）（島津公司，Lab solution工作站）;電子天平（AG135型，瑞士梅特勒公司）;超聲波清洗儀（KH-250B型，南京科爾儀器設(shè)備有限公司）;烏頭堿對(duì)照品（批號(hào) 110720-200410，中國藥品生物制品檢定研究院）;甲酸（T8124-0500，色譜純，ROE SCIENTIFIC INC.）;乙腈（色譜純，德國Merck公司）;其他試劑為分析純。

1.2 LCMS條件

1.2.1液相條件

Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×2.0 mm，4.6 μm，日本島津公司，Serial No.1052247）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（60∶40）;流速：0.2 ml/min;進(jìn)樣量：5 μl;柱溫：40℃;運(yùn)行時(shí)間：2.0 min。

1.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）;干燥氣（N2）流速：15.0 L/min;霧化氣流速（N2）：3.0 L/min;離子化方式：正離子模式;檢測方式：MRM掃描;接口電壓：4.5 kV;脫溶劑溫度：250℃;熱塊溫度：400℃;碰撞誘導(dǎo)解離電壓35 eV。

1.3微透析試驗(yàn)條件

灌流液為30%乙醇林格液;流速為1 μl/min;灌流液溫度為37℃。

1.4含藥林格液的配制

分別取8.599 g氯化鈉（NaCl）、0.144 g氯化鈣（CaCl2）及0.298 g氯化鉀（KCl）置于1000 ml量瓶中，加超純水溶解定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，即得林格液。林格液加入適量體積的乙醇，即得30%（V/V）乙醇林格液。

精密稱取烏頭堿對(duì)照品適量，加30%乙醇林格液使溶解，即得含藥林格液。

1.5微透析回收率的計(jì)算方法

減量法：RL=（Cperfusate-Cdialysis）/Cperfusate×100%;增量法：RG=Cdialysis/CECF×100%。

其中，Cdialysis為微透析樣品中的烏頭堿濃度，Cperfusate為灌流液中烏頭堿的濃度，CECF為烏頭堿-30%林格液中的烏頭堿濃度。

2結(jié)果

2.1 LCMS方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系考察

精密稱取烏頭堿對(duì)照品適量，置于100 ml量瓶中，加30%乙醇林格液溶解定容至刻度，得濃度為118 μg/ml的烏頭堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取烏頭堿對(duì)照品儲(chǔ)備液2、5、10、20及40 μl于10 ml量瓶中，加30%乙醇林格液定容至刻度，得系列烏頭堿對(duì)照品溶液。取系列對(duì)照品溶液按檢測條件進(jìn)樣，以色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，樣品濃度（ng/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系見圖1。結(jié)果顯示，烏頭堿在23.6～472.0 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2專屬性考察

分別吸取空白灌流液（30%乙醇林格液）、烏頭堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，方法專屬性較好。

2.1.3日內(nèi)精密度和日間精密度考察

取烏頭堿對(duì)照品溶液，于同一天內(nèi)各濃度分別進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算RSD;連續(xù)3 d進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。精密度考察結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，儀器日內(nèi)精密度RSD為1.08%，日間精密度RSD為1.02%，方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性考察

取烏頭堿對(duì)照品溶液分別于0、2、8、12及24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，計(jì)算峰面積RSD，穩(wěn)定性結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，峰面積RSD為1.29%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2微透析體外回收率影響因素考察

2.2.1灌流液流速對(duì)微透析體外回收率的影響

2.2.1.1減量法? 將皮膚微透析探針的透析膜完全浸沒在空白-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫維持在37℃。分別以1、2、3 μl/min的流速灌注一定濃度的烏頭堿-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，每個(gè)流速收集40 μl微透析樣品。測定微透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和灌注前烏頭堿-30%乙醇林格液中的烏頭堿濃度（Cperfusate），按減量法公式計(jì)算回收率RL。減量法灌流液流速對(duì)體外回收率的影響見圖3。結(jié)果顯示，隨著灌流液流速的增加，微透析體外回收率逐漸下降。

2.2.1.2增量法? 將皮膚微透析探針的透析膜完全浸沒在含烏頭堿濃度為0.1 μg/ml的烏頭堿-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫維持在37℃。分別以1、2、3 μl/min的流速灌注空白-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，收集微透析樣品，每個(gè)流速收集40 μl微透析樣品。按測定微透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和灌注前烏頭堿-30%林格液中的烏頭堿濃度（CECF），按增量法公式計(jì)算回收率RG。增量法灌流液流速對(duì)體外回收率的影響見圖4。結(jié)果顯示，隨著灌流液流速的增加，微透析體外回收率逐漸下降。

2.2.1.3小結(jié)? 增量法與減量法研究的灌流液流速對(duì)微透析體外回收率影響的結(jié)果一致，均顯示隨著灌流速度的增加，微透析體外回收率呈下降趨勢?？紤]到取樣量及取樣間隔時(shí)間，最終確定本實(shí)驗(yàn)研究用灌注速度為1 μl/min。

2.2.2烏頭堿濃度對(duì)微透析體外回收率的影響

2.2.2.1減量法? 將皮膚微透析探針的透析膜完全浸沒在空白-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫維持在37℃。以1 μl/min的流速分別灌注烏頭堿濃度為0.025、0.05、0.1 μg/ml的烏頭堿-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，每個(gè)濃度收集40 μl微透析樣品。測定微透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和對(duì)應(yīng)的灌注前烏頭堿-30%乙醇林格液中的烏頭堿濃度（Cperfusate），按減量法公式計(jì)算回收率RL。減量法灌流液中烏頭堿濃度對(duì)體外回收率的影響見圖5。結(jié)果顯示，烏頭堿濃度的變化對(duì)微透析體外回收率并無顯著影響。

2.2.2.2增量法? 將皮膚微透析探針的透析膜分別完全浸沒在含烏頭堿濃度為0.025、0.05、0.1 μg/ml的烏頭堿-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫維持在37℃。以1 μl/min的流速分別灌注空白-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，每個(gè)濃度收集40 μl微透析樣品。測定微透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和灌注前烏頭堿-30%林格液中的烏頭堿濃度（CECF），按增量法公式計(jì)算回收率RG。增量法烏頭堿濃度對(duì)體外回收率的影響見圖6。結(jié)果顯示，烏頭堿濃度的變化對(duì)微透析體外回收率并無顯著影響。

2.2.2.3小結(jié)? 增量法與減量法研究的烏頭堿濃度對(duì)微透析體外回收率影響的結(jié)果一致，均顯示微透析體外回收率與烏頭堿濃度無關(guān)。

2.2.3環(huán)境溫度對(duì)體外回收率的影響

2.2.3.1減量法? 將皮膚微透析探針的透析膜完全浸沒在空白-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫分別維持在25、30、35、40℃。以1 μl/min的流速分別灌注一定濃度的烏頭堿-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，每個(gè)溫度收集40 μl微透析樣品。測定微透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和對(duì)應(yīng)的灌注前烏頭堿-30%乙醇林格液的烏頭堿濃度（Cperfusate），按減量法公式計(jì)算回收率RL。減量法環(huán)境溫度對(duì)體外回收率的影響見圖7。結(jié)果顯示，微透析體外回收率隨環(huán)境溫度的升高而增加。

2.2.3.2增量法? 將皮膚微透析探針的透析膜完全浸沒在含烏頭堿濃度為0.1 μg/ml的烏頭堿-30%乙醇林格液中，持續(xù)攪拌，水溫分別維持在25、30、35、40℃。以1 μl/min的流速灌注空白-30%乙醇林格液，平衡1.5 h后，每個(gè)溫度收集40 μl微透析樣品。按上述色譜條件測定透析樣品中烏頭堿濃度（Cdialysis）和灌注前烏頭堿-30%林格液中烏頭堿的濃度（CECF），按增量法公式計(jì)算回收率RG。增量法環(huán)境溫度對(duì)體外回收率的影響見圖8。結(jié)果顯示，微透析體外回收率隨著環(huán)境溫度的升高而增加。

2.2.3.3小結(jié)? 增量法與減量法研究的環(huán)境溫度對(duì)微透析體外回收率影響的結(jié)果一致，均顯示隨著環(huán)境溫度的增加，微透析體外回收率呈上升趨勢，故在實(shí)驗(yàn)過程中要注意維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫恒定。

綜上所述，微透析可用于烏頭堿貼劑的透皮研究，灌流液流速為1 μl/min，溫度維持在37℃。

3討論

目前常用的烏頭堿測定方法有反相高效液相色譜（RP-HPLC）法、HPLC法等，但烏頭堿貼劑中藥物劑量較低，且由于皮膚的屏障作用，采用HPLC法不能準(zhǔn)確測定微透析樣品中的透過量，故本研究采用LCMS方法研究其透皮藥動(dòng)學(xué)，方法專屬性較好，能準(zhǔn)確測定其含量。

進(jìn)行微透析取樣時(shí)，由于灌流液處于流動(dòng)狀態(tài)，藥物在微透析半透膜兩側(cè)的擴(kuò)散不能達(dá)到絕對(duì)平衡，導(dǎo)致微透析樣品中的藥物濃度會(huì)低于體內(nèi)實(shí)際的藥物濃度[17]。為了獲得生物體內(nèi)真實(shí)的藥物濃度，必須考察微透析探針對(duì)該藥物的回收率，常用的方法有增量法和減量法。微透析探針的回收率作為微透析技術(shù)用于在體藥濃度研究的關(guān)鍵，受灌流液速度、溫度、待測藥物性質(zhì)、藥物濃度的影響[18-20]。探針回收率的影響因素研究結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，探針回收率增加，提示在進(jìn)行在體研究時(shí)要注意保持動(dòng)物體溫恒定。

[參考文獻(xiàn)]

[1]安婧嫻，劉芳.近年來烏頭屬植物二萜生物堿化學(xué)成分及其鎮(zhèn)痛活性研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2016，14（5）：521-525.

[2]李鴻燕，黃春英，葉朝鈞，等.烏頭乙醇提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].中國現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（6）：27-29.

[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？衫m(xù)技術(shù)出版社，1986：228.

[4]石軍民.中藥烏頭的合理使用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，12（27）：92，97.

[5]許廷生，梁秀蘭，盧壯.烏頭類藥物中毒的防治[J].河南中醫(yī)雜志，2005，25（6）：65.

[6]Yi M，Peng W，Chen X，et al.Effect of hypaconitine combined with liquiritin on the expression of calmodulin and connexin 43 in rat cardiac muscle in vivo[J].J Pharm Pharmacol，2012，64（11）：1654-1658.

[7]周天梅，楊潔紅，萬海同，等.附子甘草主要成分配伍對(duì)烏頭堿致大鼠傳代心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（1）：22-26，75.

[8]Sun GB，Sun H，Meng XB，et al.Aconitine-induced Ca2+ overload causes arrhythmia and triggers apoptosis through p38 MAPK signaling path way in rats[J].Toxicol Appl Pharmacol，2014，279（1）：8-22.

[9]孫虎，王平，龔彥勝，等.中藥透皮吸收藥理研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（9）：7-9，32.

[10]季亞軍.微透析取樣技術(shù)在中藥體內(nèi)分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床，2012，15（1）：46-48.

[11]Darvesh AS，Carroll RT，Geldenhuys WJ，et al.In vivo brain microdialysis：advances in neuropsychopharmacology and drug discovery[J].Expert Opin Drug Dis，2011，6（2）：109-127.

[12]Holmgaard R，Nielsen JB，Benfeldt E.Microdialysis sampling for investigations of bioavailability and bioequivalence of topically administered drugs：current state and future perspectives[J].Skin Pharmacol Phys，2010，23（5）：225-243.

[13]Gallardo E，Madrona A，Palma-Valdés R，et al.Effect of intracerebral hydroxytyrosol and its nitroderivatives on striatal dopamine metabolism：A study by in vivo microdialysis[J].Life Sci，2015，134（8）：30-35.

[14]Isaksson B，D■ouza MA，Jersenius U，et al.Continuous assessment of intrahepatic metabolism by microdialysis during and after portal triad clamping[J].J Surg Res，2011，169（2）：214-219.

[15]Zhang Q，Wu D，Wu J，et al.Improved blood-brain barrier distribution：effect of borneol on the brain pharmacokinetics of kaempferol in rats by in vivo microdialysis sampling[J].J Ethnopharmacol，2015，162（5）：270-277.

[16]Lu CM，Hou ML，Lin LC，et al.Development of a microdialysis system to monitor lamivudine in blood and liver for the pharmacokinetic application in herbal drug interaction and the gene expression in rats[J].J Pharm Biomed Anal，2014，96（8）：231-240.

[17]張巖，何治芬，湯湛，等.氧化苦參堿體內(nèi)外微透析回收率的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（9）：3108-3111.

[18]Tholance Y，Barcelos G，Quadrio I，et al.Analytical validation of microdialysis analyzer for monitoring glucose，lactate and pyruvate in cerebral microdialysates[J].Clin Chim Acta，2011，412（7-8）：647-654.

[19]Stenken JA.Methods and issues in microdialysis calibration[J].Anal Chim Acta，1999，379（3）：337-358.

[20]張巖，何治芬，湯湛，等.苦參堿體內(nèi)外微透析回收率的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（22）：2031-2035.

（收稿日期：2019-11-11）