不同濃度葡萄糖對兔角膜上皮細胞凋亡的影響

姚盼盼，盛敏杰，陳 麗，陸佳俊，李 敏，李 冰

(1.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院眼科，上海 200090；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院眼科，上海 200032)

目前糖尿病患者干眼發(fā)病率為63%[1]，且干眼的病情更為嚴重，治愈率更低。研究表明，糖尿病誘發(fā)干眼的機制包括淚膜不穩(wěn)定[2]、淚液滲透壓升高[3]、眼表炎癥損害[4]、角膜神經(jīng)感覺異常[5]和角結(jié)膜上皮細胞凋亡失衡等[6]。與正常人群相比，糖尿病患者角膜上皮基底細胞密度明顯降低[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reciculm stress, ERS)是細胞對多種病理狀況的一種自適應機制，ERS過強，凋亡通路將被激活誘導細胞死亡[8]。PERK、eIF2α和CHOP是ERS信號通路所屬蛋白。其中PERK、eIF2α蛋白主要在ERS時參與未折疊蛋白反應(unfold protein response, UPR)以增強細胞抗應激能力，促進存活，CHOP在過度應激環(huán)境中，可促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化，進一步導致未折疊蛋白的累積，加重細胞損傷，從而誘導凋亡[9]。

高糖通過誘導大量活性氧產(chǎn)生激活ERS介導角膜表層組織損傷已在兔角膜上皮細胞(rabbit corneal epithelial cells, RCECs)中得到驗證[10]。但葡萄糖濃度是否參與眼表細胞ERS的調(diào)控尚未有文獻報道。研究發(fā)現(xiàn)高滲可通過激活氧化應激和ERS促進RCECs的凋亡[3]。葡萄糖濃度升高伴隨著滲透壓升高，淚糖濃度對RCECs的影響是否與滲透壓的改變具有相關性需進一步的研究。本研究擬探討葡萄糖濃度對RCECs生長的影響，以期對糖尿病性干眼的發(fā)生機制更深一步認識。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Dispase Ⅱ 中性蛋白酶和蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司，0.05% EDTA-胰酶購自美國HyClone公司，角質(zhì)上皮細胞培養(yǎng)基和青鏈霉素混合物購自美國ScienCell 公司，胎牛血清美國購自Gibco公司，葡萄糖和甘露醇粉末購自美國Sigma公司，PERK Antibody、phospho-PERK Antibody、phospho-eIF2α Antibody和CHOP Antibody購自美國Cell Signaling Technology公司，eIF2α Antibody購自美國Enzo Life Sciences公司，BCA試劑盒、β-actin Antibody、HRP標記IgG二抗和顯影定影試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國SHEL LAB公司，倒置相差顯微鏡系日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，垂直轉(zhuǎn)移電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

1.2 兔角膜上皮細胞原代培養(yǎng)的建立及細胞分組

RCECs的原代培養(yǎng)參照參考文獻[3]的方法進行并行免疫熒光鑒定。第1代RCECs接種于6孔板，密度為4×105個/孔，細胞貼壁后融合率達到80%左右時，改加入不含血清的培養(yǎng)液預處理過夜。取適量的葡萄糖和甘露醇粉末分別溶解于細胞培養(yǎng)液配制母液，抽濾除菌后備用，排除其他影響因素。各孔細胞隨機分為3組：(1)對照組，僅含5.5mmol/L葡萄糖；(2)高滲組，含5.5mmol/L葡萄糖和27.5mmol/L甘露醇；(3)高糖組，僅含33mmol/L葡萄糖。濃度參照參考文獻[11]。

1.3 Westren印跡法

細胞干預24h后吸除培養(yǎng)液，適量PBS漂洗3遍，加入120μL含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解10min。將含裂解蛋白的所有液體吸出，轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管，迅速置于4℃離心機離心(離心半徑20cm，14000r/min，10min)，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管。用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白濃度。剩余蛋白樣品加入適量4×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，迅速置于100℃水中煮10min。各組均取40μg變性總蛋白選擇10%或12%的分離膠進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，將總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉或5% BSA的1×TBST封閉液封閉PVDF膜，室溫孵育1h。棄封閉液，用TBST封閉液稀釋的一抗孵育，4℃過夜(稀釋比例PERK和eIF2α為1∶2000；p-eIF2α為1∶1000；p-PERK為1∶500；CHOP為1∶1000，β-actin為1：4000)。TBST洗膜3次，每次10min，孵HRP標記的對應來源的二抗，稀釋比例1∶(4000～5000)，室溫1h。TBST 洗膜3次，每次10min，ECL顯色試劑盒顯色，于暗室膠片曝光，膠片取出后，依次置于顯影液和定影液中快速漂洗，最后用清水沖凈晾干。掃描儀掃描X射線膠片上的條帶，用Image J對條帶進行灰度值半定量分析，以目的蛋白與β-actin內(nèi)參灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

1.4 兔角膜上皮細胞形態(tài)學觀察

按照1.2所介紹方法重新培養(yǎng)第1代RCECs并行饑餓過夜處理，選取孔板中生長旺盛且形成良好單層的細胞，置于倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。棄原培養(yǎng)液，再用PBS洗兩次，清除脫落的細胞及雜質(zhì)，各孔細胞隨機加入等量的含不同濃度的葡萄糖和甘露醇的無血清培養(yǎng)液。葡萄糖濃度梯度依次為200、400、600和800mmol/L；甘露醇濃度梯度依次為200、400、600和800mmol/L；葡萄糖和甘露醇混合液總濃度均為800mmol/L，濃度之比分別為1∶3、1∶1和3∶1。以空白組作為對照組。每孔含3個復孔。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于24h后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.5 上皮細胞顯微鏡下變化分級標準

通過計算倒置相差顯微鏡下異常形態(tài)RCECs百分比(異常形態(tài)RCECs面積/9.6cm2)進行損傷程度分級。培養(yǎng)后的上皮細胞生長正常為(-)，細胞出現(xiàn)球形或呈聚攏狀為(+)，細胞呈彌漫性皺縮大量空泡并有灶性脫落<20%為(++)，細胞皺裂、壞死脫落20%～50%為(+++)，細胞灶性脫落50%～75%為(++++)，細胞灶性脫落>75%為(+++++)。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組兔角膜上皮細胞p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白的表達

與對照組和高滲組相比，高糖組兔角膜上皮細胞p-PERK、p-eIF2α和CHOP表達水平升高(P<0.05)；高滲組與對照組相比p-PERK、p-eIF2α和CHOP表達上調(diào)(P<0.05)；各組中，PERK和eIF2α表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 兔角膜上皮細胞PERK,p-PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP蛋白的表達

2.2 高糖與高滲狀態(tài)下兔角膜上皮細胞形態(tài)變化的比較和分析

2.2.1 兔角膜上皮細胞形態(tài)變化與高糖水平的關系 隨著葡萄糖濃度在200～800mmol/L范圍內(nèi)不斷升高，100倍率下可見細胞脫落范圍不斷擴大，200和400倍率下可見細胞皺縮、體積縮小、細胞碎裂、胞間連接消失等損傷不斷加重，細胞生長形態(tài)越來越差。200、400、600、800mmol/L葡萄糖濃度下細胞損傷分別為(+)、(+)、(+++)、(+++++)，見圖2。

圖2 不同高糖濃度處理的RCECs生長形態(tài)

2.2.2 兔角膜上皮細胞形態(tài)變化與滲透壓濃度水平的關系 隨著甘露醇濃度在200～800mmol/L范圍內(nèi)不斷升高，100倍率下可見細胞脫落范圍不斷擴大，200和400倍率可見細胞皺縮、空泡化、體積縮小，細胞碎裂、胞間連接消失等情況不斷加重，細胞生長形態(tài)越來越差。與圖2相比，濃度為400mmol/L和600mmol/L 時，甘露醇均較葡萄糖致細胞生長形態(tài)差和脫落范圍大。200、400、600、800mmol/L甘露醇濃度下細胞損傷分別為(+)、(++)、(++++)、(+++++)，見圖3。

圖3 不同滲透壓濃度處理的RCECs生長形態(tài)

2.2.3 滲透壓維持不變時，不同高糖濃度下兔角膜上皮細胞形態(tài)變化 隨著葡萄糖濃度在200～600mmol/L范圍內(nèi)不斷升高，且各組滲透壓保持平衡，與空白對照組相比，100倍率下可見細胞脫落范圍逐漸縮小，200和400倍率可見細胞皺縮、體積縮小，細胞碎裂、胞間連接消失等情況呈明顯減輕趨勢，細胞形態(tài)異形性減弱。200mmol/L葡萄糖+600mmol/L甘露醇細胞損傷為(++++)；400mmol/L葡萄糖+400mmol/L甘露醇細胞損傷為(+++)；600mmol/L葡萄糖+200mmol/L甘露醇細胞損傷為(++)，見圖4。

圖4 同等滲透壓不同高糖濃度處理的RCECs生長形態(tài)

2.2.4 高糖及高滲對兔角膜上皮細胞的影響 為了更直觀地表示出這些結(jié)果的差異及可能的相互關系，根據(jù)倒置相差顯微鏡下觀察到RCECs生長形態(tài)隨葡萄糖和甘露醇的濃度變化而改變的趨勢，推測出其相關關系進行表示。

結(jié)論發(fā)現(xiàn)：(1)細胞損傷程度隨葡萄糖濃度的升高而加重。葡萄糖較同濃度的甘露醇對細胞損傷更輕微，到達一定的濃度如800mmol/L時，兩種處理下細胞均大片脫落死亡，高糖與高滲致細胞損傷程度相當，見圖5A；(2)同等高滲透壓條件下，細胞損傷程度隨葡萄糖濃度升高而減輕，與圖5A相符合，見圖5B；(3)結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白高糖組較高滲組表達明顯升高的結(jié)果進行分析，推測輕度高糖較輕度高滲對細胞的損傷程度相對較重，而重度高糖較重度高滲對細胞的損傷程度相對較輕過程較緩慢，直至超過一定的濃度時，兩種作用均直接導致細胞死亡，見圖5C(由于本實驗濃度跨度范圍大，圖5與真實的曲線關系存在一定的偏差)。

圖5 倒置相差顯微鏡下RCECs損傷百分比與葡萄糖和甘露醇濃度的相關性推測及比較

3 討 論

淚膜穩(wěn)定是維持眼表上皮正常結(jié)構(gòu)和保持健康視覺功能的重要基礎?，F(xiàn)認為糖尿病性干眼是高淚糖引起淚膜損害伴角結(jié)膜上皮細胞損傷過多的結(jié)果[12]，且病情與血糖控制情況和糖尿病病程相關[13]。淚液高糖可引起淚液滲透壓的增加，且淚液滲透壓隨著糖尿病病程的增加而升高[14]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對內(nèi)外環(huán)境的刺激極為敏感，當其發(fā)生功能紊亂時未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集的狀態(tài)被稱為ERS。應激早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過啟動UPR，如暫停蛋白質(zhì)的合成、激活分子伴侶和折疊酶基因等的轉(zhuǎn)錄活性、誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關性蛋白降解以促進細胞存活。若ERS過強，凋亡通路將被激活誘導細胞死亡[15]。前期實驗通過高糖干預RCECs發(fā)現(xiàn)，高糖組(1mmol/L葡萄糖)p-PERK和CHOP蛋白表達水平較滲透壓對照組(0.5mmol/L NaCl)相比明顯上調(diào)[10]。本次實驗顯示，與正常組相比，高糖組和高滲組RCECs p-PERK、p-eIF2α和CHOP表達水平均升高，且高糖組較高滲組表達水平上調(diào)，與前期實驗結(jié)果相符?？梢?，高糖組較高滲組RCECs遭受應激強，細胞損傷嚴重，高糖較高滲對細胞影響大。這與血液透析過程中預防性應用甘露醇(60～100mL/h)透析失衡綜合征的發(fā)生率較高滲糖(40～60mL/h，50%葡萄糖)低[16]的現(xiàn)象相一致。因此，高淚糖對RCECs的損傷不限于滲透壓的升高，還包括高糖本身的毒性作用。

葡萄糖屬于有機物但又可電離，因此既有膠體滲透壓又有晶體滲透壓。甘露醇和葡萄糖分子式相近，在醫(yī)藥上是良好的利尿劑，不可電離，具有強滲透性[17]。為了更直觀地觀察高糖對角膜上皮的損傷作用，本次實驗探究了葡萄糖濃度對RCECs生長的影響，甘露醇做對照。顯微鏡觀察表明，在200～800mmol/L范圍內(nèi)，與空白組相比，葡萄糖濃度越高RCECs生長形態(tài)越差，如可見細胞皺縮、體積縮小、空泡化、胞間連接消失、細胞脫落與細胞碎裂等，細胞損傷趨向嚴重。因此，在此范圍內(nèi)，葡萄糖誘導的RCECs損傷與其濃度呈量-效關系，驗證了干眼與糖尿病血糖控制情況的相關性[13]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，葡萄糖較同濃度的甘露醇處理過的細胞生長形態(tài)更好，細胞損傷范圍小。當滲透壓平衡時，RCECs損傷隨葡萄糖濃度升高而減輕。因此，在此范圍內(nèi)，葡萄糖對RCECs的毒性效應弱于甘露醇。此時，高糖對RCECs的損傷中高滲所發(fā)揮的作用大于高糖本身。

此實驗結(jié)果與上部分高糖組較高滲組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白表達上調(diào)結(jié)果相悖。淚膜滲透壓正常值是312mmol/L，高滲透壓是指超過閾值316mmol/L，但個別患者的指標可高至360mmol/L[18]?？梢酝茰y，淚膜滲透壓較高時，眼表微環(huán)境可迅速代償以達到新的平衡，對細胞損傷輕微，而葡萄糖代謝紊亂累積的毒性代謝產(chǎn)物滯留致細胞損傷嚴重[19]；超高滲情況下，滲透壓對RCECs的刺激較急劇，葡萄糖既是能量儲備，還可以被消耗從而降低滲透壓，細胞損傷由輕到重有個累積過程，較高滲對細胞的影響緩慢。糖尿病患者人群血糖值范圍波動較大，臨床上糖尿病性酮癥酸中毒或者是糖尿病高滲性昏迷的患者，血糖可以高達33～55mmol/L此時已危及生命。因此，糖尿病患者血糖水平多小于33mmol/L。糖尿病患者淚糖濃度約為血糖濃度1/6[20]，因此，糖尿病患者高淚糖的滲透壓可在淚膜代償范圍內(nèi)，對細胞刺激小，但葡萄糖本身過量的糖化反應是造成角結(jié)膜上皮損傷的關鍵。在高淚糖慢性刺激細胞的過程中，伴隨的滲透壓升高對細胞的影響較小，而糖代謝紊亂所產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物不斷累積和滯留激活一些病理性通路如ERS誘導細胞死亡，并導致角結(jié)膜上皮的損傷，這是一個長期累積且不可逆的過程。

綜上，在臨床上糖尿病患者體內(nèi)的日積月累的糖化反應遠超過伴隨的滲透壓升高所帶來的影響，這些研究結(jié)果將有助于為治療糖尿病性干眼提供新的理論依據(jù)和靶標。由于本實驗為離體研究且細胞為兔源，在下一步的研究中將考慮采用人或鼠上皮以及自發(fā)糖尿病小鼠動物模型進一步研究證實。