尼莫地平預(yù)處理對燒傷大鼠認知功能的影響

劉天琳 瞿敏

[摘要]目的 探討尼莫地平對燒傷大鼠認知功能的影響及其作用機制。方法 選擇健康的18月齡SD雄性大鼠32只。用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組（n=8）：對照組（C組）、手術(shù)組（S組）、尼莫地平組（D組）、尼莫地平+手術(shù)組（D+S組）。D、D+S組腹腔注射1 mg/kg尼莫地平，C、S組給予等量生理鹽水;30 min后S組和D+S組給予麻醉后造燒傷模型;C組為空白對照組。術(shù)前1 d及術(shù)后第1、3、7天采用Morris水迷宮實驗記錄大鼠逃避潛伏期和穿越次數(shù)。Morris水迷宮完成后處死大鼠取海馬，采用ELISA檢測海馬區(qū)的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）;采用RT-PCR法測定海馬Bax、Bcl-2的mRNA表達量。流式細胞儀測量海馬神經(jīng)元凋亡率。結(jié)果 C、D組術(shù)后第1、3、7天平均逃避潛伏期、穿越次數(shù)與術(shù)前1 d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與C組比較，S、D+S組術(shù)后第1、3、7天的平均逃避潛伏期延長、穿越次數(shù)減少（P<0.05）。與S組比較，D+S組術(shù)后第1、3、7天的平均逃避潛伏期縮短、穿越次數(shù)增加（P<0.05）。與S組比較，D+S組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平降低，Bax mRNA表達量降低，Bcl-2 mRNA表達量升高，Bax/Bcl-2比值降低，凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 尼莫地平可通過抑制炎癥反應(yīng)、降低海馬神經(jīng)元凋亡改善燒傷老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙。

[關(guān)鍵詞]尼莫地平;凋亡率;認知功能;燒傷

[中圖分類號] R614.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）7（c）-0012-05

Effect of Nimodipine pretreatment on cognitive function in burned rats

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1. The Second Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Hebei Province， Cangzhou? ?061100， China; 2. Department of Anesthesiology， Children′s Hospital of Cangzhou Central Hospital， Hebei Province， Cangzhou? ?061100， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Nimodipine on cognitive function in burned rats and its mechanism. Methods A total of 32 healthy male SD rats aged 18 months were selected. The rats were divided into four groups （n=24） by random number table method： control group （group C）， surgery group （group S）， Nimodipine group （group D）， Nimodipine + surgery group （group D+S）. Groups D and D+S were intraperitoneally injected with 1mg/kg Nimodipine， while groups C and S were given the same amount of normal saline; 30 min later， the group S and group D+S were anesthetized and burned models were created. Group C was the blank control group. Morris water maze method was used to record the escape latency and crossing times of rats 1 day before operation and the 1st， 3rd， 7th days after operation. After completing， the Morris water maze， the rats were sacrificed and their hippocampus were collected. The tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in the hippocampus were detected by ELISA. MRNA expressions of hippocampal Bax and Bcl-2 were determined by RT-PCR. The apoptosis rate of hippocampal neurons was measured by flow cytometry. Results Compared with 1 day before the operation， there were no significant differences in the average escape latent period and crossing times between group C and group D on the 1st， 3rd， and 7th days after operation （P>0.05）. Compared with group C，the average escape latent period of group S and D+S was prolonged and the crossing times were reduced on the 1st，3rd and 7th days after operation （P>0.05）. Compared with group S ， the average escape latent period of the group D+S at the same time was shortened and the crossing times at the same time were increased on the 1st，3rd and 7th days （P<0.05）. Compared with group S， the levels of TNF-α and IL-6 in the hippocampus of the rats in the group D+S were decreased， the mRNA expression of Bax in hippocampal neurons was reduced， the mRNA expression of Bcl-2 was increased， the ratio of Bax/Bcl-2 was reduced， and the apoptosis rate was decreased （P<0.05）. Conclusion Nimodipine can improve postoperative cognitive dysfunction in burned elderly rats by inhibiting inflammatory response and decreasing hippocampal neuron apoptosis.

[Key words] Nimodipine; Apoptosis rate; Cognitive function; Burned

認知功能障礙是術(shù)后常見的神經(jīng)精神并發(fā)癥，多見于老年人，可導(dǎo)致住院時間延長，影響術(shù)后生活質(zhì)量，甚至影響患者轉(zhuǎn)歸，危及生命。術(shù)后認知功能障礙的機制非常復(fù)雜，有炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等[1]，目前凋亡機制是當(dāng)前研究熱點之一[2]。

燒傷一般是指由熱力、蒸汽、高溫氣體、火焰等引起的皮膚和/或黏膜的組織損傷[3]。重度燒傷常伴有多個器官、系統(tǒng)的損傷。隨著燒傷的治療理念日趨完善、治療方法不斷精進，燒傷病死率明顯降低，而其引起的精神障礙逐漸成為主要問題之一。Palmu等[4]研究認為，在平均燒傷面積為9%總體表面積的燒傷患者中精神疾患發(fā)病率為60%。燒傷不僅直接破壞皮膚和局部血管的完整性，同時對毛細血管的通透性有著廣泛影響。燒傷區(qū)域炎癥因子激活，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)[5]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等介質(zhì)參與了燒傷后的炎癥反應(yīng)。

尼莫地平是二氫吡啶類Ca2+通道拮抗劑，其親脂性高，易透過血腦屏障，選擇性阻斷L-型Ca2+通道，同時擴張腦血管，增加腦血流量，具有腦保護作用[6]。據(jù)報道，尼莫地平可降低燒傷大鼠血漿炎癥因子水平[7]，但是尼莫地平在燒傷大鼠中抗炎作用與腦保護作用的關(guān)系尚不清楚。因此，本實驗建立燒傷大鼠認知功能障礙模型，探討尼莫地平改善認知功能障礙的機制，以期為患者燒傷后防治認知功能障礙提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1一般材料

選擇健康的SD雄性大鼠32只，18月齡，體重400～550 g，室溫保持在（21±1）℃。均由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證編號：SCXK（冀）2018-0001]。本研究已經(jīng)過滄州市中心醫(yī)院動物實驗中心管理委員會批準。

用隨機數(shù)字表法將32只大鼠分為4組（n=8）：對照組（C組）、尼莫地平組（D組）、手術(shù)組（S組）、尼莫地平+手術(shù)組（D+S組）。D、D+S組大鼠腹腔內(nèi)注射1 mg/kg尼莫地平（德國，Bayer Schering Pharma AG公司，生產(chǎn)批號：BXG5XLL，規(guī)格：50 ml），C、S組大鼠給予等量生理鹽水;30 min后S組和D+S組大鼠給予10%水合氯醛（江蘇永華化學(xué)科技有限公司，生產(chǎn)批號：20180922）350 mg/kg麻醉后造燒傷模型;C組為空白對照組。所有大鼠統(tǒng)一進食水。此研究只選取雄性大鼠避免發(fā)情周期帶來的潛在影響。

1.2動物模型制備

根據(jù)文獻[8]，將銅塊置于95～100℃水浴鍋1 min，待大鼠麻醉后，銅塊接觸鼠背皮膚持續(xù)30 s。然后給予生理鹽水3 ml/100 g皮下注射，進行液體復(fù)蘇[9]。隨后將其置于38～40℃恒溫毯上進行保溫，待大鼠恢復(fù)自主活動，即造模完成。D+S組造模前30 min給予1 mg/kg尼莫地平腹腔內(nèi)注射;C組、D組不給予銅塊燙傷造模。所有大鼠給予相同飼養(yǎng)環(huán)境以及相同的抓捕方式，以保證實驗條件的一致性。

1.3行為學(xué)測試

術(shù)前1 d及燒傷模型建立后1、3、7 d進行Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司水迷宮分析系統(tǒng)）測試，具體如下。

一個黑色透明的圓形水池（直徑180 cm，高50 cm，深32 cm）內(nèi)充滿了24～26℃的水，滴入黑色無毒油墨使其變得不透明，水池被等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4個象限，在Ⅳ象限水面以下2 cm放置一個直徑12 cm、高30 cm的圓形平臺。水池周圍的環(huán)境和室內(nèi)燈光保持不變。大鼠在測試前接受4 d訓(xùn)練。在每天的訓(xùn)練中，將大鼠分別放置在4個象限，面向池壁放入水池中，120 s內(nèi)找不到平臺將被引導(dǎo)到平臺上，并允許在平臺上停留15 s。每次訓(xùn)練結(jié)束后，泳池都要進行清潔以消除異味。每天訓(xùn)練4次，上午和下午同一時間各2次。術(shù)前1 d及術(shù)后第1、3、7天，將各組大鼠放入池中，記錄逃避潛伏期（從落水至爬上目標平臺之前所花費的時間）。取下平臺，記錄60 s內(nèi)大鼠游過平臺原位置的頻率，將兩次測試的平均值作為最終結(jié)果。

1.4 ELISA測海馬TNF-α、IL-6

行為學(xué)測試結(jié)束后，用水合氯醛深麻醉，去除顱骨分離大鼠腦部組織，用冰生理鹽水灌洗腦部組織，迅速在冰上剝離覆蓋在海馬組織上的大腦皮層，暴露大鼠海馬組織。取出后立即在2～8℃，5000 r/min，離心5 min。將海馬勻漿離心上清液儲存于-80℃。根據(jù)說明書，使用ELISA法檢測TNF-α及IL-6水平。

1.5采用RT-PCR法測定海馬Bax、Bcl-2的mRNA表達量

從海馬組織中提取總RNA。使用NanoDrop ND-2000（NanoDrop Technologies，威明頓市，美國）測定RNA濃度和純度。使用相應(yīng)的引物按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，威明頓市，美國）。實時定量PCR采用RT-PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，美國），SYBR Green Master Mix試劑盒（ABI Biosystem，CA）。采用DNAMAN4.0程序設(shè)計引物，Bcl-2 mRNA上游引物為5′-GAGCGTCAACAGGGAGATGT-3′，下游引物為5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′。Bax mRNA上游引物為5′-TTGCTACAGGGTTTCATCCA-3′，下游引物為5′-TGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3′。β-actin：上游引物為5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物為5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。按RT-qPCR程序操作。cDNA合成：按說明書使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒。采用PCR基因擴增儀進行擴增。半定量分析：于2%瓊脂糖凝膠電泳槽中，分別加入PCR產(chǎn)物與Marker I，電壓120 V，電泳35 min，于凝膠成像分析系統(tǒng)采集產(chǎn)物圖像，應(yīng)用Image J2x軟件對圖像進行分析。Bcl-2、Bax mRNA表達量采用目的片段與內(nèi)采光密度值的比值來表示，重復(fù)測定3次，取平均值。

1.6流式細胞儀測凋亡率

取大鼠海馬組織，制備流式細胞儀凋亡檢測方法。經(jīng)胰蛋白酶化后收集細胞。按照說明書使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（KeyGEN BioTECH，中國南京），流式細胞儀（FCM，BD Biosciences，美國）檢測細胞凋亡。細胞凋亡的檢測采用Modfit軟件進行細胞DNA含量分析，低于G1期二倍體DNA含量的細胞為凋亡細胞。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量的方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗;不符合正態(tài)分布者采用中位數(shù)（M）表示，比較采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

2.1.1四組大鼠不同時間點平均逃避潛伏期的比較? 在水迷宮定位航行訓(xùn)練中，C、D組大鼠術(shù)后第1、3、7天的平均逃避潛伏期與術(shù)前1 d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與C組比較，S、D+S組大鼠術(shù)后第1、3、7天的平均逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與S組比較，D+S組大鼠術(shù)后第1、3、7天的平均逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

與C組同時間點比較，aP<0.05;與S組同時間點比較，bP<0.05

2.1.2四組大鼠空間探索實驗結(jié)果的比較? C、D組大鼠術(shù)后第1、3、7天的穿越次數(shù)與術(shù)前1 d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與C組比較，S、D+S組術(shù)后第1、3、7天大鼠的穿越次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與S組比較，D+S組大鼠術(shù)后第1、3、7天的穿越次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

與C組同時間點比較，aP<0.05;與S組同時間點比較，bP<0.05

2.2四組大鼠海馬TNF-α、IL-6表達量的比較

與C組比較，S、D+S組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與S組比較，D+S組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D兩組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

與C組比較，aP<0.05;與S組比較，bP<0.05

2.3四組大鼠海馬Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達量和Bax/Bcl-2的比較

與C組比較，S、D+S組大鼠海馬區(qū)Bax mRNA表達量升高，Bcl-2 mRNA表達量降低，Bax/Bcl-2比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與S組比較，D+S組大鼠海馬神經(jīng)元Bax mRNA表達量降低、Bcl-2 mRNA表達量升高，Bax/Bcl-2比值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D兩組大鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2 mRNA表達量和Bax/Bcl-2比值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

與C組比較，aP<0.05;與S組比較，bP<0.05

2.4四組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率的比較

與C組比較，S、D+S組大鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與S組比較，D+S組大鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D兩組大鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表5）。

與C組比較，aP<0.05;與S組比較，bP<0.05

3討論

認知功能障礙通常發(fā)生在術(shù)后早期階段，其特征是在接受麻醉手術(shù)后近遠期出現(xiàn)認知能力減退、記憶受損、睡眠及情感紊亂等癥狀[10-11]。大量證據(jù)表明，海馬神經(jīng)元凋亡是認知功能損害的關(guān)鍵一環(huán)[12-13]。據(jù)報道，尼莫地平預(yù)處理可以抑制吸入異氟醚致鈣超載誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，提高老齡大鼠術(shù)后的認知能力[14]，本實驗探討尼莫地平預(yù)處理對燒傷大鼠認知功能的作用及其機制。

Morris水迷宮[15]測試包括定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗可以考察動物學(xué)習(xí)記憶的能力，空間探索實驗可測試動物的空間聯(lián)想能力和反應(yīng)記憶能力。因此，本實驗選擇Morris水迷宮實驗來評價老年燒傷大鼠的認知能力。實驗結(jié)果顯示，建立大鼠燒傷模型后逃避潛伏期明顯延長，穿越原平臺次數(shù)明顯減少，提示認知功能障礙模型制備成功。

尼莫地平是一種親脂性鈣拮抗劑。研究表明，尼莫地平可通過降低神經(jīng)元凋亡，改善認知[16]。本實驗結(jié)果顯示，與S組比較，D+S組大鼠的術(shù)后逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數(shù)明顯增加（P<0.05），提示尼莫地平預(yù)處理可改善燒傷老齡大鼠術(shù)后記憶和學(xué)習(xí)能力，改善術(shù)后認知功能。

燒傷可引起強烈的炎癥反應(yīng)，燒傷面積越大，精神癥狀越嚴重，發(fā)生精神癥狀的患者中大約有28%的患者出現(xiàn)腦組織血流動力學(xué)的下降和大腦皮質(zhì)及海馬組織神經(jīng)元的缺失[17]。本實驗結(jié)果顯示，與C組比較，S、D+S組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平升高（P<0.05），提示燒傷可誘發(fā)強烈的炎癥反應(yīng);與S組比較，D+S組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平降低（P<0.05），提示尼莫地平改善燒傷老齡大鼠術(shù)后認知功能可能與降低海馬區(qū)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

凋亡是一種細胞程序性死亡。Bax和Bcl-2均是Bcl-2家族的重要分子，Bax蛋白表達增加提示細胞凋亡傾向增加，Bcl-2水平升高則提示凋亡概率下降，兩者的表達比率決定著細胞最終的生命走向[18]。本實驗結(jié)果顯示，與C組比較，S、D+S組大鼠海馬區(qū)Bax mRNA表達量升高，Bcl-2 mRNA表達量降低，Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05），提示手術(shù)造成海馬神經(jīng)元凋亡傾向增加;與S組比較，D+S組大鼠海馬神經(jīng)元Bax mRNA表達量升高、Bcl-2 mRNA表達量降低，Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05），提示尼莫地平預(yù)處理可改善海馬神經(jīng)元凋亡。與流式細胞儀海馬神經(jīng)元凋亡率結(jié)果相一致。

綜上所述，尼莫地平預(yù)處理燒傷老年大鼠可改善術(shù)后認知功能，這種保護作用至少與減輕海馬區(qū)炎癥反應(yīng)、降低海馬神經(jīng)元凋亡率相關(guān)。

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（收稿日期：2020-01-09）