結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境研究

張之亮 蘇琳

結(jié)直腸癌( colorectal cancer，CRC）是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)的惡性腫瘤中發(fā)病率中居 3-5位[1-2]，世界范圍內(nèi)CRC 預(yù)計(jì)新增 136萬(wàn)新發(fā)病例和69萬(wàn)死亡病例，超過(guò)一半的CRC患者容易發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前，結(jié)直腸癌的臨床檢測(cè)主要是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability， MSI）、RAS基因、BRAF基因等。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展一個(gè)重要途徑，其可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因突變的大量產(chǎn)生，進(jìn)而形成大量新的抗原，增加機(jī)體的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抑制腫瘤的狀態(tài)[3-5]。FDA 已批準(zhǔn)免疫抑制劑用于患有微衛(wèi)星高不穩(wěn)定型（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)缺陷型（dMMR）轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者[6]。RAS基因是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的下游基因，RAS基因突變可以激活RAS/MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致結(jié)直腸癌對(duì)抗EGFR靶向藥物產(chǎn)生耐藥[7-9]，免疫耐受及逃避機(jī)制在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[10]。腫瘤免疫微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）[11]對(duì)于抗腫瘤起著重要作用，腫瘤微環(huán)境由非腫瘤細(xì)胞（如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）、構(gòu)成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞、免疫和炎性細(xì)胞、骨髓來(lái)源細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成，它們產(chǎn)生生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子和基質(zhì)降解酶，促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移[12-13]。目前的結(jié)直腸癌免疫治療方法僅對(duì)部分亞型表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答率，大部分患者免疫應(yīng)答率仍然較低在本文中，我們將闡述結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境的特征以及對(duì)于臨床的免疫治療提供指導(dǎo)價(jià)值。

1 一般資料與方法

1.1 結(jié)直腸癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢索與整理

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載美國(guó)Illumina公司RNA-seq的level3數(shù)據(jù)，為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)處理。最終，我們共獲得了437例結(jié)直腸癌 RNA數(shù)據(jù)及相關(guān)的臨床信息(性別、年齡、生存狀態(tài)和生存期等)。美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載項(xiàng)目集分別是GSE42284（n=188）和GSE24551（n=160）且這兩個(gè)數(shù)據(jù)集都帶有臨床數(shù)據(jù)。

1.2 分層聚類分析

采用單個(gè)樣本聚類的分析方法（ssGSEA）把表達(dá)譜數(shù)據(jù)解析出29種免疫的細(xì)胞、免疫因子和免疫通絡(luò)的豐度，我們利用ESTIMATEA軟件評(píng)估免疫細(xì)胞分值、基質(zhì)細(xì)胞的分值以及免疫純度分值。利用層次聚類的方法，把結(jié)直腸癌的樣本進(jìn)行免疫分型。

1.3 基因集變異功能富集和22種免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)豐度分析

基因集變異分析（GSVA），是一種非參數(shù)的無(wú)監(jiān)督分析方法，主要用來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)錄組的基因集功能富集結(jié)果。CIBERSORT是基于線性支持向量回歸的原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的一個(gè)工具，可用RNA-Seq的數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度。

1.4 生存曲線分析

針對(duì)我們篩選出來(lái)的結(jié)直腸中免疫微環(huán)境中的高中低免疫組，采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線來(lái)預(yù)測(cè)總生存率，并使用時(shí)序檢驗(yàn)（log-rank test）來(lái)檢驗(yàn)高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存曲線是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組

TCGA下載的結(jié)直腸癌的RNA-seq數(shù)據(jù)，基于ssGSEA解析出來(lái)29種免疫的細(xì)胞、免疫因子和免疫通絡(luò)的豐度，通過(guò)層次聚類可以把結(jié)直腸癌中的免疫微環(huán)境分為高中低免疫組（圖1a），并且這種方法在GSE42284數(shù)據(jù)集中進(jìn)行同樣分析，結(jié)果顯示GSE42284數(shù)據(jù)集的樣本也能分為高中低免疫組（圖1b）。

2.2 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組通路和22種免疫細(xì)胞的差異

基于GSVA分析，篩選出每個(gè)樣本的基因富集的豐度的通路矩陣，高免疫組vs.低免疫組進(jìn)行差異通路分析，基于這些差異通路進(jìn)行有監(jiān)督聚類分析（圖2a），通過(guò)熱圖可以看到intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineage等通路在高免疫組的活性高于低免疫組?；贑IBERSORT[14]軟件評(píng)估的22種免疫細(xì)胞的豐度在高中低組免疫的差異（圖2b）。T cells CD8、T cells follicular helper、Macrophages M1和 Dendritic cells resting等免疫細(xì)胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。然而Macrophages M0 、Macrophages M2 、T cells CD4 memory resting 等在高免疫組低于免疫組。

2.3 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組CD274和CTLA4的表達(dá)以及生存曲線分析

圖1 基于ssGSEA解析的結(jié)果，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GSE42284數(shù)據(jù)集中，結(jié)直腸癌分為高中低免疫組，其中低免疫組（最左側(cè)）和高免疫組（最右側(cè)）用框標(biāo)出，中間沒有框標(biāo)出的是低免疫組。

CD274和CTLA4在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中隨著免疫活性的增高，表達(dá)水平顯著性是增加（圖3a，b）。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)，分別在TCGA和數(shù)據(jù)集GSE2455中分別進(jìn)行高中低免疫組生存曲線分析（圖3c，d），通過(guò)圖中分析結(jié)果，可以看出在總生存期和DFS中高免疫組高于低免疫組。

3 討論

癌癥的發(fā)展是由于腫瘤細(xì)胞不斷地在逃避抗腫瘤免疫，而作為腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視和免疫逃逸的發(fā)生部位[15]，腫瘤免疫微環(huán)境與CRC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)[16-17]。然而對(duì)于結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的特征分析研究很少。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境進(jìn)行了高中低免疫組的亞型分析，且能夠在獨(dú)立數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證。研究顯示Macrophages M0 和Macrophages M2 在高免疫組低于免疫組，然而Macrophages M1在高免疫組低于免疫組。腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最多的免疫細(xì)胞，可以分泌多種細(xì)胞因子，在腫瘤發(fā)生的初期，能夠識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，但隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移起著“雙刃劍”的作用。其中Macrophages M0 和Macrophages M2促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。T cells CD8和T cells follicular helper等免疫細(xì)胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。浸潤(rùn)腫瘤的T淋巴細(xì)胞，特別是CD8+T 細(xì)胞及與T細(xì)胞受體結(jié)合后產(chǎn)生IFN-γ、腫瘤壞死因子靶向腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞清除[18]。 濾泡輔助T細(xì)胞是一種新的CD4＋輔助性T細(xì)胞亞群，能持續(xù)分泌趨化因子受體而發(fā)生免疫作用。從而又激活對(duì)intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineagede等免疫通路起到激活作用。盡管本研究未繼續(xù)深入探討免疫微環(huán)境影響結(jié)直腸癌不同免疫組的具體分子機(jī)制 ，但是我們的研究利用不同角度證明了高免疫組患者處于免疫激活狀態(tài)。且高免疫組與低免疫組比CD274的表達(dá)顯著性的增加。FDA已批準(zhǔn)PD-L1免疫抑制劑應(yīng)用于晚期實(shí)體瘤種[19-21]，如黑色素瘤、肺癌。因此，根據(jù)我們的方法篩選出來(lái)的高免疫組患者，可嘗試PD-L1免疫抑制劑治療的探索研究。

圖2 富集的通路（2a）和22種免疫細(xì)胞（2b）在結(jié)直腸癌高中低免疫組差異

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CD274和CTLA4在高中低免疫組的表達(dá)（3a，b）以及 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)集GSE24551中的結(jié)直腸癌高中低免疫組的生存曲線分析（3c，d）

綜上所述，免疫微環(huán)境逐漸成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，現(xiàn)有的結(jié)直腸癌免疫治療方法僅對(duì)部分亞型表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答率，大部分患者免疫應(yīng)答率仍然較低，仍需多中心、大樣本量研究，以滿足其在多數(shù)結(jié)直腸癌患者中的有效性與安全性，從而使更多患者獲益。結(jié)直腸癌免疫治療是一個(gè)有前景性的治療選擇，值得進(jìn)一步研究探索。