豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測(cè)方法的建立

劉 婕，閆文朝，錢偉鋒，韓利方，薛 瑞

（河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023）

肉孢子蟲病是由肉孢子蟲（Sarcocystis）引起的一種人獸共患寄生蟲病，能感染哺乳動(dòng)物、鳥類及人等宿主，在動(dòng)物群體中感染率較高[1-2]。目前能夠感染豬的肉孢子蟲有3 種，即米氏肉孢子蟲（S. miescheriana）、豬人肉孢子蟲（S.suihominis）和豬貓肉孢子蟲（S.porcifelis），其中米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲在世界各地均有相關(guān)報(bào)道，其種的有效性得到公認(rèn)[2-3]。但豬貓肉孢子蟲僅在少數(shù)局部地區(qū)有報(bào)道，因數(shù)據(jù)資料缺乏，其種的有效性尚存在爭(zhēng)議[2-3]。

肉孢子蟲的生活史需要中間宿主和終末宿主[4-5]。豬人肉孢子蟲以人為終末宿主，人感染后的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、腹瀉、嘔吐，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)脫水和關(guān)節(jié)酸痛等癥狀，嚴(yán)重危害人的健康[6-8]。肉孢子蟲的包囊主要寄生于豬的膈肌、頸背側(cè)肌、腿肌、心肌等部位[9-11]，會(huì)引起仔豬發(fā)熱、貧血、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀，引起懷孕母豬流產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡[2,5]。包囊寄生在宿主心肌和骨骼肌中并發(fā)生炎性反應(yīng)，造成肉類產(chǎn)品污染及廢棄[3]。

建立敏感、特異和快捷的肉孢子蟲檢測(cè)技術(shù)對(duì)豬肉孢子蟲病防控具有重要意義。目前肉孢子蟲常用的檢測(cè)方法主要是肌肉壓片鏡檢法[12-13]，該法雖然操作簡(jiǎn)單，但是目前已知的米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲包囊均是小型包囊，肉眼不易發(fā)現(xiàn)，在顯微鏡下其與脂肪滴和結(jié)締組織相似，容易誤診。另外，肌肉壓片鏡檢法檢出率偏低[12]。與常規(guī)PCR 相比，套式PCR 技術(shù)具有更靈敏更特異的優(yōu)點(diǎn)[14]，多重PCR 具有一管PCR 反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種病原DNA 的便捷和高效優(yōu)勢(shì)[15]?；诖?，本研究將套式PCR 和多重PCR 結(jié)合建立了豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉和血液等樣品中米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲的準(zhǔn)確、快速鑒別檢測(cè)，為豬肉孢子蟲病診斷和分子流行病學(xué)研究提供高效的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料2×EasyTaq? PCR SuperMix、DL2000 Plus DNA Marker、EasyPure? Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T1 克隆載體、EasyPure? Plasmid MiniPrep Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司、細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；3 g～5 g 鏡檢包囊陽性、并經(jīng)PCR 鑒定分別為米氏肉孢子蟲和枯氏肉孢子蟲的豬肉和牛肉以及不含肉孢子蟲包囊的豬肉均來自洛陽冷鮮肉專賣店；剛地弓形蟲和犬新孢子蟲速殖子為本實(shí)驗(yàn)室保存。各肉制品經(jīng)組織勻漿后，提取其基因組DNA 以及剛地弓形蟲和犬新孢子蟲速殖子的基因組DNA；從洛陽地區(qū)超市和冷鮮肉專賣店購(gòu)買22 份新鮮肉樣。這些基因組DNA 和肉樣于-20 ℃保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成從GenBank 下載米氏肉孢子蟲（JN256123、JX840465）18S rRNA 和豬人肉孢子蟲18S rRNA 基因序列（MH404229、KP732435），利用DNASTAR-MegAlign 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用軟件Oligo 6.0 分別在這兩個(gè)18S rRNA 基因序列均保守區(qū)設(shè)計(jì)豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 外引物EXPCF/R（表1），再在這兩個(gè)孢子蟲18S rRNA 基因序列的變異區(qū)分別設(shè)計(jì)米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲特異性套式PCR 內(nèi)引物INPM2F/R 和INPSF/R（表1），內(nèi)、外引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 的引物Table 1 Primers of the duplex nested PCR assay for detecting the Sarcocystis species in pig samples

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定以米氏肉孢子蟲包囊陽性肉樣的基因組DNA 為模板，利用外引物EXPCF/RPCR 擴(kuò)增米氏肉孢子蟲18S rRNA 基因序列，并克隆到pEASY-T1 載體中，通過菌落PCR和測(cè)序鑒定獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-Sm18S rRNA；根據(jù)GenBank 中豬人肉孢子蟲18S rRNA 基因序列（MH404229）[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成豬人肉孢子蟲18S rRNA 序列，并克隆到pEASY-T1 載體中，通過菌落PCR 和測(cè)序鑒定獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-Ss18S rRNA。利用分光光度計(jì)測(cè)定和計(jì)算這兩種重組質(zhì)粒的濃度（ng/μL），再按照公式M=（6.02×1023）×（X1 ng/μL×10-9）/（（質(zhì)粒堿基數(shù)X2×660）=拷貝數(shù)/μL，計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)[14]，最后將兩種質(zhì)粒均稀釋成3×1010拷貝/μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 單巢式PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化參考文獻(xiàn)[16]，采用25 μL反應(yīng)體系，兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為3×104拷貝/μL，作為DNA 模板，分別以外引物EXPCF/R和內(nèi)引物INPM2F/R 及INPSF/R（表1）進(jìn)行單巢式PCR 擴(kuò)增，引物濃度設(shè)置為2.0 μmol/L、1.5 μmol/L、1.0 μol/L、0.5 μmol/L。第一輪PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃30 s、72 ℃90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；將第一輪PCR 產(chǎn)物10 倍稀釋后作為模板，進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：

94 ℃5 min；94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃30 s、72 ℃40 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。評(píng)價(jià)米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲單巢式PCR 內(nèi)、外引物的擴(kuò)增效率，優(yōu)化最佳引物濃度和退火溫度等反應(yīng)條件。

1.5 雙重套式PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化參考1.4 單巢式PCR最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行雙重套式PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化。外引物和內(nèi)引物濃度分別設(shè)置為2.0 μmol/L、1.5 μmol/L、1.0 μmol/L、0.5 μmol/L。在外引物（EXPCF/R）的擴(kuò)增反應(yīng)管中加入米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各1 μL 作為模板，兩種質(zhì)粒濃度均為3×104拷貝/μL，第一輪PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃40 s、72 ℃90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；將PCR 產(chǎn)物10 倍稀釋后，取1 μL 作為模板，加入米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲兩種內(nèi)引物（INPM2F/R 和INPSF/R），進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃40 s、72 ℃40 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果優(yōu)化內(nèi)、外引物合適濃度和最佳退火溫度。

1.6 雙重套式PCR 方法的特異性試驗(yàn)采用優(yōu)化的反應(yīng)條件，以剛地弓形蟲和犬新孢子蟲速殖子基因組DNA、不含肉孢子蟲包囊的豬肉基因組DNA、米氏肉孢子蟲和枯氏肉孢子蟲包囊基因組DNA、豬人肉孢子蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲重組質(zhì)粒混合樣品為模板，進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增，以評(píng)價(jià)雙重套式PCR 的特異性。

1.7 雙重套式PCR 方法的敏感性試驗(yàn)采用優(yōu)化的反應(yīng)條件，以10 倍倍比稀釋的米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（0.5×104拷貝/μL～5×104拷貝/μL）為模板，進(jìn)行雙重套式PCR 擴(kuò)增，評(píng)價(jià)其敏感性。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)將22 份豬肉樣品每份采集3 g～5 g 肉樣勻漿后，提取組織總DNA 作為模板，采用本研究建立的雙重套式PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)采用肌肉壓片鏡檢方法[12-13]檢測(cè)這些臨床樣品的肉孢子蟲，比較二者的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果經(jīng)菌落PCR 和測(cè)序分析，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEASY-T1-Sm18S rRNA包含了正確的1 476 bp 米氏肉孢子蟲18S rRNA 基因序列；重組質(zhì)粒pEASY-T1-Ss18S rRNA 包含了正確的1 500 bp 豬人肉孢子蟲18S rRNA 基因序列。經(jīng)測(cè)定，pEASY-T1-Sm18S rRNA 為235.4 ng/μL，pEASYT1-Ss18S rRNA 為289.2 ng/μL。根據(jù)公式計(jì)算重組質(zhì) 粒pEASY-T1-Sm18S rRNA 為3.97×1010拷 貝/μL，pEASY-T1-Ss18S rRNA 為4.86×1010拷貝/μL。將二者分別稀釋至3.0×1010拷貝/μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單巢式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲的單巢式PCR優(yōu)化結(jié)果顯示，其反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)、外引物濃度均為0.5 μmol/L。外引物（EXPCF/R）的最佳退火溫度是56 ℃，循環(huán)中的延伸時(shí)間是90 s；米氏肉孢子蟲內(nèi)引物（INPM2F/R）的最佳退火溫度是57 ℃，循環(huán)中的延伸時(shí)間是40 s；豬人肉孢子蟲內(nèi)引物（INPSF/R）的最佳退火溫度是58 ℃，循環(huán)中的延伸時(shí)間是40 s。

2.3 雙重套式PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲的雙重套式PCR 優(yōu)化結(jié)果顯示，其反應(yīng)體系為25 μL，最佳內(nèi)、外引物濃度均為0.5 μmol/L。最佳PCR 擴(kuò)增條件：第一輪擴(kuò)增條件為94 ℃5 min；94 ℃40 s、56 ℃40 s、72 ℃90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；第二輪PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min；94 ℃40 s、58 ℃40 s、72 ℃40 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期一致，外引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 476 bp，米氏肉孢子蟲內(nèi)引物（INPM2F/R）擴(kuò)增長(zhǎng)度為415 bp；豬人肉孢子蟲內(nèi)引物（INPSF/R）擴(kuò)增長(zhǎng)度為591 bp，片段大小差別明顯（圖1），可以很好的區(qū)分。

圖1 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplication results of the duplex nested PCR assay for detecting the Sarcocystis species in pig sample

2.4 雙重套式PCR 的特異性試驗(yàn)結(jié)果特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究建立的雙重套式PCR 方法對(duì)枯氏肉孢子蟲、剛地弓形蟲、犬新孢子蟲和不含肉孢子蟲包囊的豬肉基因組等樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，而米氏肉孢子蟲包囊基因組、豬人肉孢子蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pEASY-T1-Ss18S rRNA、米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲重組質(zhì)?；旌蠘悠肪鶖U(kuò)增出目的條帶（圖2），表明本實(shí)驗(yàn)建立的雙重套式PCR 具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果。Fig.2 Specificity of the duplex nested PCR specific assay

2.5 雙重套式PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，雙重套式PCR 對(duì)米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲18S rRNA 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限均為5 拷貝/μL，但是擴(kuò)增條帶比較弱；50 拷貝/μL 以上濃度的重組質(zhì)粒均擴(kuò)增出較明亮的目的條帶（圖3）。表明本實(shí)驗(yàn)建立的雙重套式PCR 具有較高的敏感性。

圖3 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity of the duplex nested PCR assay

2.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果雙重套式PCR 對(duì)22 份豬肉樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，有5 份樣品為米氏肉孢子蟲陽性，沒有檢測(cè)出豬人肉孢子蟲，17 份陰性樣品；肌肉壓片鏡檢結(jié)果顯示，有3 份樣品為肉孢子蟲陽性，19 份樣品為陰性。經(jīng)計(jì)算，本研究建立的多重套式PCR 方法與肌肉壓片鏡檢陽性符合率為100%，陰性符合率為89.5%，總體符合率為90.9%（表2）。表明本研究建立的雙重套式PCR 方法比肌肉壓片鏡檢具有更高的敏感性，可用于臨床樣品的檢測(cè)。

表2 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of the PCR assay for clinical samples

3 討 論

肉孢子蟲是一種重要的食源性人獸共患寄生蟲，不僅引起豬、牛等動(dòng)物發(fā)病和死亡，而且也存在感染人等的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)[2,7]。豬感染肉孢子蟲孢子囊后，在其肝臟等臟器血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)裂殖生殖，最后裂殖子隨血流到達(dá)骨骼肌和心肌等部位形成大量包囊[2-3]，此時(shí)在病豬的骨骼肌、心肌、血液和臟器組織中均存在肉孢子蟲不同發(fā)育階段的蟲體。如果犬科動(dòng)物、靈長(zhǎng)類或人等終末宿主食入生的或不熟的、攜帶有肉孢子蟲包囊的豬肉就會(huì)被感染，在終末宿主的小腸完成配子生殖和孢子生殖，最后隨糞便排出孢子囊[8,17-18]。因此，有效檢測(cè)豬的肌肉、血液、臟器以及犬和人糞便中的肉孢子蟲蟲體可為豬和人肉孢子蟲病防控提供重要依據(jù)。

目前肉孢子蟲檢測(cè)最常用的方法是肌肉壓片鏡檢法，但該方法無法確定肉孢子蟲的種類，并且敏感性低，容易出現(xiàn)誤診和漏診[11,13]。隨后又有報(bào)道基于18S rRNA基因序列的分子鑒定方法，這些方法通常是利用肉孢子蟲屬通用引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序和序列比對(duì)分析來確定肉孢子蟲種類[11,19]。該方法雖然快捷，但由于是通用引物，可能存在非特異性擴(kuò)增問題，導(dǎo)致鑒定效率較低。本研究通過對(duì)米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲的18S rRNA 基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，首先在兩種肉孢子蟲均保守區(qū)設(shè)計(jì)上、下游引物，作為雙重套式PCR 的外引物，然后在兩種肉孢子蟲18S rRNA 基因序列的變異區(qū)分別設(shè)計(jì)米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲種特異性引物，作為內(nèi)引物。通過優(yōu)化條件，建立了雙重套式PCR，能夠檢測(cè)豬肉樣本中米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲。相對(duì)肌肉壓片鏡檢和常規(guī)PCR 方法，該雙重套式PCR 具有較高的敏感性[14-16]，為肉樣衛(wèi)生檢測(cè)、豬肉孢子蟲病例診斷和流行病學(xué)研究提供方便有效的檢測(cè)手段。

由于在實(shí)驗(yàn)過程中沒有擴(kuò)增到豬人肉孢子蟲的全長(zhǎng)18S rRNA 基因，所以本研究根據(jù)GenBank 登錄的豬人肉孢子蟲18S rRNA 基因序列，委托生物公司人工合成了1 500 bp 豬人肉孢子蟲的18S rRNA 基因序列，并克隆到pEASY-T1 載體中，獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-Ss18S rRNA 作為豬人肉孢子蟲標(biāo)準(zhǔn)品。本研究還構(gòu)建了米氏肉孢子蟲重組質(zhì)粒pEASYT1-Sm18S rRNA 作為米氏肉孢子蟲標(biāo)準(zhǔn)品。總之本研究建立的豬源肉孢子蟲雙重套式PCR 方法為豬肉孢子蟲病診斷和分子流行病學(xué)研究提供了高效的檢測(cè)手段。