西藏那曲市牦牛源莫拉桿菌的分離鑒定與敏感藥物篩選

馬弘財，元振杰，張麗鴻，李脂幸，吳慶俠，儲岳峰，羅建勛，李家奎，曾江勇*

（1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046）

莫拉桿菌（Moraxella bovis）是牛傳染性角膜結(jié)膜炎（紅眼病Pink eye）的主要病原[1]，根據(jù)相關(guān)研究，莫拉桿菌引起的傳染性角膜結(jié)膜炎呈逐年上升趨勢[2-4]。在美國[4-6]、日本[2-4]、巴基斯坦[7]等國家將莫拉桿菌定為眼部疾病的病原菌。牛莫拉桿菌（Moraxella bovis）又稱牛嗜血桿菌，該病原菌可通過接觸傳染給健康牛，但主要還是通過蠅類及一些飛蛾機械性傳播[1,8]。該菌革蘭氏染色呈陰性，對培養(yǎng)基的要求較高，在鮮血平板培養(yǎng)基生長較好，有些菌種可以在麥康凱培養(yǎng)基上生長，莫拉桿菌不分解任何糖類，吲哚試驗為陰性[9]。

莫拉桿菌雖然感染的部位是眼睛，但該病在美國最常見的牛病中居于第二位[9]，常引起較大的經(jīng)濟損失。該菌致病率較低，對人和動物通常沒有較大的危害[3]，所以研究該菌的報道也相對較少，莫拉桿菌感染引起的牛傳染性角膜結(jié)膜炎需要在強烈的太陽紫外光照射下才能產(chǎn)生典型的臨床癥狀[1]，西藏那曲平均海拔4 500 m 及以上，有著強烈的太陽紫外光，為該菌感染牦牛并表現(xiàn)出致病癥狀提供了天然條件，致使西藏牦牛普遍感染該病，嚴重者導(dǎo)致牦牛失明，如治療不及時還可能導(dǎo)致死亡，所以在西藏研究該病原菌具有重要意義。

實地調(diào)查顯示該病主要集中感染24 月齡以下的牦牛犢牛，每年9 月～11 月發(fā)病最為嚴重。西藏那曲2017 年11 月首次發(fā)現(xiàn)該病，病初臨床表現(xiàn)為體溫升高、眼睛紅腫、持續(xù)性流淚、后期為眼角黃色膿液，失明等癥狀，發(fā)病率高達90%以上。

為了掌握莫拉桿菌對牦牛的感染情況及采取有效的防治措施，2019年本研究室在西藏那曲發(fā)病區(qū)無菌采集具有體溫升高、眼睛紅腫、持續(xù)性流淚、眼角黃色膿液、失明等臨床癥狀牦牛的28 份鼻拭子及30 份眼拭子，開展了牦牛源莫拉桿菌的分離鑒定與敏感藥物篩選，為今后更好的治療和防控該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品與主要試劑28 份眼拭子和與其對應(yīng)牛的28 份鼻拭子，以及另外2 頭牦牛的眼拭子，均采自西藏那曲發(fā)病區(qū)發(fā)病牦牛。

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、全套生化鑒定管、藥敏紙片均購自青島海博生物科技有限公司；脫纖綿羊血購自上海索萊寶科技有限公司；rTaq DNA 聚合酶、PCR 試劑和DL2000 DNA Marker 均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 細菌分離培養(yǎng)將無菌采集的鼻拭子和眼拭子樣品置于含血清的滅菌TSB 肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h 后用接種環(huán)劃線于脫纖維綿羊鮮血培養(yǎng)基，37 ℃需氧培養(yǎng)24 h；挑取帶有寬溶血環(huán)的單個菌落劃線接種于脫纖維綿羊鮮血培養(yǎng)基，37 ℃需氧培養(yǎng)24 h，進行細菌的純化。連續(xù)4 代純化培養(yǎng)后經(jīng)革蘭氏染色鏡檢。

1.3 分離菌株的生化試驗按照生化試劑說明書，將純化的單菌落分別接種于賴氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶、枸櫞酸鹽、H2S、尿素、蛋白胨、苯丙氨酸、甘露醇，葡糖糖，吲哚、MR-VP 和山梨醇的生化培養(yǎng)管中，37 ℃需氧培養(yǎng)24 h，觀察其生化反應(yīng)特性，分析試驗結(jié)果。

1.4 16S rRNA 基因的PCR 擴增及序列分析挑取單菌落，按照常規(guī)方法，利用16S rRNA 通用引物進行菌液PCR 擴增，引物序列為F27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/R1492：5'-TACGGCTACCTT GT TACGACTT-3'，引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成，擴增長度約為1 487 bp。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后由武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序。

將測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄的莫拉桿菌進行同源性比對分析，并利用DNAStar 軟件構(gòu)建該細菌16S rRNA 基因的遺傳進化樹。

1.5 藥敏試驗采用常規(guī)紙片法[10]，檢測本研究分離菌株對復(fù)方新諾明、萬古霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、紅霉素、多西環(huán)素、新霉素、青霉素、苯唑西林、丁胺卡那、頭孢呋辛、頭孢他啶頭孢唑啉、慶大霉素、克林霉素、氯霉素、卡那霉素的藥物敏感性。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌的分離培養(yǎng)結(jié)果無菌采集牦牛的鼻拭子和眼拭子接種于脫纖維綿羊血培養(yǎng)基，經(jīng)連續(xù)4 代純化培養(yǎng)后可見2 株無色光滑、半透明的小菌落，并帶有溶血環(huán)，呈β溶血。符合莫拉桿菌菌落形態(tài)特征。

純化細菌經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢，呈陰性，菌體接近球狀的短小桿菌，綜合菌落形態(tài)和革蘭染色特征，結(jié)合發(fā)病牦牛臨床癥狀分析，初步判定分離菌株為莫拉桿菌。造成此次莫拉桿菌分離率較低（僅2株）的原因可能有以下幾點：首先本試驗樣品是在采樣后2 個月進行該細菌的分離，保存時間較長；其次，可能是培養(yǎng)條件不同造成的：莫拉桿菌的培養(yǎng)條件是34 ℃，需氧培養(yǎng)24 h～48 h[8]，而本實驗是按細菌的常規(guī)培養(yǎng)方式37 ℃，培養(yǎng)18 h～24 h。

本實驗是從牦牛鼻拭子中分離出來的莫拉桿菌，而非病變部位的樣品—眼拭子分離得到，這是由于鼻腔與眼睛通過鼻淚管連通，該細菌可能在兩個器官之間發(fā)生了轉(zhuǎn)移；還有本研究在采樣的時候發(fā)現(xiàn)，大部分病牛眼部的膿液都已結(jié)痂，在用棉簽蘸取病料時可能只蘸取了眼睛正常分泌物，而不是病變的膿液；再者該細菌是否會在不同時期感染不同的器官有待進一步研究。

2.2 生化試驗結(jié)果生化鑒定結(jié)果顯示，分離菌對甘露醇和山梨醇的生化試驗呈陽性，其他生化試驗結(jié)果呈陰性。所分離得到的2 株菌均符合莫拉桿菌的生化反應(yīng)特性。

2.3 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增及序列分析結(jié)果以分離菌株的DNA 為模板，采用細菌16S rRNA通用引物進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示：在約2 000 bp處可見目的條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。測序分析結(jié)果顯示目的基因與GenBank 登錄的莫拉桿菌同源性為97%～100%。16S rRNA基因遺傳進化樹結(jié)果顯示，分離菌 與 莫 拉 桿 菌（DQ153089.1 和NR_043583.2）聚 為 一支（圖2）。進一步表明本實驗分離的菌株為莫拉桿菌。本實驗分離菌株16S rRNA 基因的PCR 擴增序列與GenBank 登錄的所有莫拉桿菌16S rRNA 基因序列的同源性達到97%以上，與莫拉桿菌（DQ153089.1和NR_043583.2）序列同源性達到100%。同樣表明本研究分離的菌株為莫拉桿菌。

圖1 分離菌株16S rRNA 基因PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of 16S rRNA gene of the isolates

圖2 莫拉桿菌分離株16S rRNA 基因的遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence of the Moraxella isolates

2.4 藥敏試驗結(jié)果分離菌株的藥敏試驗結(jié)果顯示：該菌對環(huán)丙沙星、氧氟沙星、紅霉素、新霉素、丁胺卡那及諾氟沙星6 種抗生素高度敏感，而對臨床上常使用的青霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明和多西環(huán)素5 種抗生素耐藥，對頭孢類及其它藥物呈中介耐藥（表1）。

表1 分離菌株藥敏試驗結(jié)果Table 1 Result of the antibiotic sensitivity test of the isolates

據(jù)相關(guān)研究[11-13]報道，由于莫拉桿菌血清型眾多，疫苗的使用對該細菌引起的傳染性角膜結(jié)膜炎的預(yù)防沒有實質(zhì)性的作用。目前，對該細菌最有效的治療方法仍然是抗生素治療[14]，而本實驗通過藥敏試驗，初步篩選了對牦牛莫拉桿菌敏感的環(huán)丙沙星等6 種藥物，其中莫拉桿菌對紅霉素敏感的結(jié)果與巴西羊源莫拉桿菌耐藥結(jié)果一致[14]。

由于受傳統(tǒng)宗教文化的影響，以及牦牛價格較高，本研究未做動物回歸試驗，后續(xù)將通過小白鼠進一步研究莫拉桿菌的毒力及感染情況。

本研究通過對分離鑒定的2 株西藏那曲市牦牛源莫拉桿菌的藥敏試驗，篩選出一批適合當?shù)仃笈Ｔ茨瓧U菌治療的藥物，為那曲及其它牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)治療和防控牦牛傳染性角膜結(jié)膜炎的用藥提供了參考依據(jù)。