生雞屠宰場(chǎng)屠宰環(huán)節(jié)單核細(xì)胞增生李斯特菌的分子分型研究

孫曉文，陳思思，王小丁，姚 浩，田禹齊，焦新安，殷月蘭

（揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病和人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種重要的人獸共患食源性病原菌，通過肉制品、乳制品等動(dòng)物源性食品傳播，感染該致病菌后能引起發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀，致死率高達(dá)20%～30%[1]。美國、加拿大、法國等國家多次報(bào)道了李斯特菌病的暴發(fā)流行，它已嚴(yán)重威脅全球公眾健康，引起了各國政府管理部門的高度關(guān)注[2]。2000 年，WHO 將Lm 列為4大食源性病原菌之一，2000 年，我國建立了包括Lm在內(nèi)的全國食源性致病菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)，加大了對(duì)該致病菌的監(jiān)測(cè)力度。2014 年我國頒布的《食品中致病菌限量》中提出對(duì)即食肉制品中Lm 的零容忍政策。

雞肉是我國人民日常生活中重要的動(dòng)物產(chǎn)品，雞肉的生產(chǎn)加工和銷售過程中時(shí)常存在Lm 污染，給人類的健康造成了潛在的威脅。有關(guān)研究報(bào)道指出市售雞肉產(chǎn)品中Lm 的污染情況較為嚴(yán)重，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)，15%以上的禽產(chǎn)品受到Lm 污染[3]。因此了解生雞屠宰過程中Lm 的污染狀況，有利于加強(qiáng)對(duì)屠宰環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)督和管理，以預(yù)防Lm 引起的食源性疾病的發(fā)生。為探究生雞屠宰過程中Lm 的污染狀況，本研究對(duì)江蘇淮安某生雞屠宰場(chǎng)的4 個(gè)屠宰環(huán)節(jié)（燙煺、凈膛、預(yù)冷清洗、分割傳送）進(jìn)行樣品的采集，對(duì)Lm 分離株進(jìn)行血清學(xué)、多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析，明確Lm 在生雞屠宰鏈的傳播特征，為企業(yè)制定相關(guān)措施控制Lm 污染提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2018 年8 月～2018 年11 月，選擇江蘇淮安某生雞屠宰場(chǎng)定點(diǎn)采集樣品，從整個(gè)屠宰流水線選擇燙煺、凈膛、預(yù)冷清洗、分割傳送4 個(gè)環(huán)節(jié)采集肉雞胴體擦拭樣品，共采集肉雞胴體擦拭樣160 份，另外采集屠宰過程中使用的工具以及地面等環(huán)境擦拭樣品40 份。

1.2 培養(yǎng)基與試劑UVM 改良李斯特菌增菌培養(yǎng)基、Fraser 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水購自BD 公司；李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自法國科馬嘉公司；MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；Lm診斷血清購自日本生研公司。

1.3 Lm 的分離培養(yǎng)根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局李斯特菌的檢驗(yàn)方法分離Lm[4]。在棉球擦拭樣品中倒入適量的UVM 增菌液，30 ℃培養(yǎng)20 h～26 h。取100 μL 菌液加入10 mL Fraser 增菌液中，37 ℃培養(yǎng)26±2 h。取50 μL 菌液于李斯特菌顯色培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。挑取藍(lán)綠色且?guī)О咨珪灜h(huán)的單菌落在BHI 固體平板上純化培養(yǎng)，用于后期進(jìn)一步的鑒定。

1.4 分離菌株的PCR 鑒定以煮沸法提取的分離菌DNA 為模板，利用文獻(xiàn)[5]中Ino2、MonoA、Siwi2和LisB 4 種引物對(duì)分離菌進(jìn)行PCR 鑒定。

1.5 Lm 的血清型鑒定挑取BHI 固體平板上的單菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，利用基因組提取試劑盒提取分離菌株的基因組，以其為模板，利用文獻(xiàn)[6]中Lmo0737、ORF2110、ORF2819、Lmo1118 和prs 5 種基因的引物進(jìn)行PCR 鑒定，初步確定分離菌株的血清型，進(jìn)一步利用Lm 診斷血清采用玻片凝集法鑒定分離菌株的血清型，方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考產(chǎn)品說明書。

1.6 分離菌株的MLST 型按照法國巴斯德Lm 多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria. html）提 供 的7 對(duì) 管 家 基 因（abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA）進(jìn)行MLST 分型的PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物采用雙向測(cè)序，利用BioEdit 軟件將測(cè)序得到的基因序列拼接后，提交至Lm 的MLST 數(shù)據(jù)庫（https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/），從而獲得相應(yīng)的ST 型，最后利用BioNumerics 軟件繪制不同血清型和屠宰環(huán)節(jié)的最小生成樹（Minim Spainning Tree）。

2 結(jié)果與討論

2.1 Lm 的分離鑒定結(jié)果從江蘇淮安某生雞屠宰場(chǎng)屠宰環(huán)節(jié)采集的200 份樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，有40 份樣品分離出Lm，總分離率為20.0%，其中環(huán)境擦拭樣品（工具以及地面等擦拭樣品）Lm 分離率為37.5%（15/40），肉 雞 胴 體 擦 拭 樣 品Lm 分 離 率 為15.6%（25/160）。1995 年～1996 年，在瑞典肉雞屠宰場(chǎng)采集肉雞擦拭樣品，結(jié)果顯示有50%樣本檢測(cè)出Lm[7]。1998 年11 月～1999 年4 月，王 振 國 等 人 在 長春某肉雞屠宰加工廠采集152 份凍雞肉樣品，其中Lm 的檢出率為10.5%[8]。以上Lm 的流行病學(xué)調(diào)查主要針對(duì)屠宰場(chǎng)的雞肉，但對(duì)于Lm 在屠宰各個(gè)環(huán)節(jié)的污染以及傳播規(guī)律少有報(bào)道。因此，本研究對(duì)Lm在整個(gè)屠宰鏈中的傳播規(guī)律進(jìn)行了調(diào)查研究。

本研究中燙煺環(huán)節(jié)、凈膛環(huán)節(jié)未分離出Lm；分割傳送環(huán)節(jié)分離出10 株Lm，分離率為25.0%；預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)分離出15 株Lm，分離率為37.5%；地面、刀具等環(huán)境擦拭樣品中分離出15 株Lm，分離率為37.5%（圖1）。調(diào)查結(jié)果表明，Lm 污染主要存在于屠宰加工線后期。屠宰流程前期的燙煺、凈膛環(huán)節(jié)不存在Lm 污染，而在預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)Lm 污染率最高，之后的分割傳送環(huán)節(jié)的污染率較預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)略有下降。本研究中Lm 的污染規(guī)律與國外的報(bào)道基本一致：1995 年～1996 年瑞典對(duì)一家肉雞屠宰場(chǎng)的調(diào)查顯示，Lm 污染主要存在于屠宰加工線后期[7]。另外，本研究屠宰場(chǎng)的環(huán)境也存在Lm 的污染（37.5%），在屠宰場(chǎng)工人使用的刀具和地面等環(huán)境中均分離到Lm，提示該屠宰場(chǎng)屠宰操作技術(shù)及屠宰工藝有待改善。

圖1 屠宰場(chǎng)各環(huán)節(jié)Lm 的分離率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 Positive rate of Lm from different links in slaughterhouse

2.2 Lm 的血清型分型結(jié)果采用多重PCR 和O 抗原玻片凝集結(jié)合的方法檢測(cè)分離菌株的血清型。結(jié)果顯示，40 株Lm 分為3 種血清型，包括19 株血清型為1/2c（47.5%）、12 株血清型為1/2a（30.0%）、9株血清型為1/2b（22.5%）。結(jié)果表明，血清型1/2c 為分離Lm 的優(yōu)勢(shì)血清型。

2.3 Lm 的MLST 分型結(jié)果MLST 分型結(jié)果顯示，40 株Lm 共分為8 種ST 型，其中優(yōu)勢(shì)ST 型為ST9 型（16/40，40.0%），其余依次為ST87（8/40，20.0%）、ST8（4/40，10.0%）、ST101（3/40）、ST378（3/40）、ST307（2/40）、ST330(1/40)。此外，還發(fā)現(xiàn)了一種新的ST 型（圖2），它與ST9 僅有一個(gè)等位基因的差異，在7 個(gè)管家基因中，擁有6 個(gè)及以上相同等位基因的菌株屬于同一個(gè)克隆復(fù)合群（Clonal complexes，CC），結(jié)果表明新的ST 型與ST9 同屬于CC9，而CC9 在國內(nèi)食品中普遍存在，其具有引起人類李斯特菌病散發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。以顏色標(biāo)記菌株的血清型，ST9、ST101 對(duì)應(yīng)1/2a 和1/2c 兩種血清型，其它每一種ST 型均僅對(duì)應(yīng)一種血清型（圖2），結(jié)果表明，菌株的血清型與ST 型具有高度對(duì)應(yīng)性。

圖2 不同血清型Lm 的ST 型最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of Lm isolated from different serotypes

對(duì)屠宰過程中不同屠宰環(huán)節(jié)的分離菌株進(jìn)行MLST 分型比較結(jié)果顯示，不同屠宰環(huán)節(jié)的分離菌株具有相同的ST 型，ST87、ST9 型菌株均能在預(yù)冷清洗、分割傳送環(huán)節(jié)分離到（圖3）。這些結(jié)果提示，Lm 在屠宰場(chǎng)中可能是沿著屠宰鏈傳播。從進(jìn)化樹的分析來看，肉雞胴體擦拭樣和環(huán)境樣品中分離到的Lm 分離株之間存在相同的ST 型（ST9、ST87、ST8、ST101、ST307、ST378），具有比較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，表明屠宰環(huán)境和肉雞胴體之間可能存在交叉污染。

圖3 不同屠宰環(huán)節(jié)中Lm 的ST 型最小生成樹Fig.3 Minimum spanning tree of Lm isolated from different slaughtering links

本研究對(duì)Lm 的MLST 分型結(jié)果顯示，其優(yōu)勢(shì)ST 型為ST9，其次為ST87 和ST8。Chen 等對(duì)2012年～2016 年中國43 個(gè)城市1 212 份樣品中分離到的362 株食源性Lm 的MLST 分析結(jié)果顯示，ST9 為最常見的ST 型，其次為ST8、ST87[9]。這與本研究結(jié)果一致，表明市售雞肉產(chǎn)品中的Lm 污染可能來源于上游屠宰環(huán)節(jié)。值得注意的是，ST87 是引起我國人李斯特菌病的優(yōu)勢(shì)ST 型，2007 年～2012 年在中國4 個(gè)省市引起的28 例臨床李斯特菌病的Lm 中，最常見的ST 型為ST87（9/28）[10]。其次，ST8 是常見的引起人類李斯特菌病Lm 的ST 型，2004 年～2012年，丹麥大多數(shù)李斯特菌病散發(fā)病例與ST8 相關(guān)[11]?；赟T87、ST8 是該屠宰場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)ST 型，食用該屠宰場(chǎng)生產(chǎn)的雞肉產(chǎn)品可能引起人類李斯特菌病，因此需要加強(qiáng)對(duì)該屠宰場(chǎng)的監(jiān)測(cè)和衛(wèi)生管理，以降低Lm 在屠宰環(huán)節(jié)的污染，為雞肉進(jìn)入餐桌環(huán)節(jié)嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，以預(yù)防和減少食源性李斯特菌病的發(fā)生。