豬圓環(huán)病毒Ⅱ型與豬繁殖呼吸障礙綜合征混合感染的診斷

王浩先，白金洋，張 穎，倪宏波

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué))

豬圓環(huán)病毒屬圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，是一種直徑17 nm的小型，無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，分為兩種不同的基因型(PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ)[1]。PCV-Ⅱ感染所致的臨床癥狀主要有5種[2]，即豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)、豬腎病與皮炎綜合征(DNS)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬繁殖障礙(PRF)和傳染性先天性震顫(CT)。PCV-Ⅱ是斷奶多系統(tǒng)消耗綜合征(PMWS)的主要病因，其特征是進(jìn)行性消瘦，呼吸障礙，腎病綜合征和先天性震顫[3]。此外，由于PCV-Ⅱ是免疫抑制病毒，因此患病豬更容易受到其他病毒和細(xì)菌的侵害。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)又稱(chēng)藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的烈性傳染病。引起該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[4,5]。豬群感染PRRSV的臨床癥狀因不同生長(zhǎng)階段或輕重程度表現(xiàn)各異。主要的臨床表現(xiàn)有流產(chǎn)、病毒血癥與發(fā)熱、分娩障礙、拒食、母豬死亡、仔豬帶毒、斷奶前死亡率增加、弱仔。嚴(yán)重程度與豬群的應(yīng)激狀況、并發(fā)感染、管理水平及病毒型等相關(guān)[5]。

1 材料與方法

1.1病料來(lái)源 安達(dá)市某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)80余頭40日齡斷奶仔豬，生長(zhǎng)遲緩，嚴(yán)重消瘦，精神沉郁，食欲下降或廢絕，全身被毛粗亂，皮膚蒼白，呼吸急促，偶有咳嗽和喘氣，曾發(fā)生嘔吐和腹瀉。有豬瘟和偽狂犬的疫苗免疫史。

1.2送檢樣本 安達(dá)市某規(guī)?；i場(chǎng)送檢的一頭40日齡患病豬，無(wú)菌采集患病豬肝、肺、脾、腎及小腸。

1.3檢測(cè)試劑 MgCl2、10×Buffer、DL 2000 DNA Marker、dNTP、Taq DNA聚合酶(均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)、TIAN amp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司)、RNA simple Total RNA Kit RNA提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司)、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific-CN公司、生理鹽水、去離子水、DEPC水、消化液、蛋白酶K、酚、酚-氯仿-異戊醇、氯仿-異戊醇、無(wú)水乙醇等。

1.4引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中公開(kāi)發(fā)表的豬瘟病毒(HC)、豬普通致病性豬藍(lán)耳病(PRRS)、豬圓環(huán)病毒 Ⅱ型(PCV Ⅱ)、豬偽狂犬病毒(PR)的基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性上下游引物。

1.5核酸提取及鑒定

1.5.1病料處理 無(wú)菌取各臟器小塊病料，加DEPC水2 mL置于研磨管研磨，將研磨后的樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2組織DNA提取 使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作步驟提取組織總DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3組織RNA提取 使用RNAsimple Total RNA Kit 總RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作步驟提取組織總RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4RNA反轉(zhuǎn)錄 使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒，按說(shuō)明書(shū)操作步驟將病毒提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到的cDNA在-20℃進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.5PCR擴(kuò)增及核酸電泳 用得到的DNA和cDNA為模板，圓環(huán)病毒及藍(lán)耳病毒特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1剖檢變化 病豬有腹膜炎和間質(zhì)性肺炎癥狀、胸腔積液，肺臟出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎癥狀，胃腸鼓氣、胃底部有多量出血點(diǎn)(圖1)，腎臟外觀灰紅色，表面有結(jié)節(jié)、小出血點(diǎn)，切面有多量出血點(diǎn)，脾頭嚴(yán)重腫大，邊緣增寬，淡紅黃色，有出血點(diǎn)(圖2)，進(jìn)一步切開(kāi)后可見(jiàn)盲腸的回盲口部分有輕度的充血和腫脹，腸壁增厚，小腸腸粘膜有褶皺(圖3)。

圖1 胃底部出血點(diǎn)

圖2 脾頭腫大增寬

圖3 腸粘膜褶皺

2.2PCR結(jié)果 PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在PCR擴(kuò)增圖的PCV中有880 bp左右的條帶，與豬圓環(huán)病毒預(yù)期片段大小相符，在PCR擴(kuò)增圖的PRRSV中有300 bp左右的條帶，與豬藍(lán)耳病病毒預(yù)期片段大小相符(圖4)。

圖4 PCR擴(kuò)增圖

2.3細(xì)菌學(xué)檢查 取病豬肺、肝、脾接種血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.4分析 根據(jù)PCR結(jié)果，判定為豬圓環(huán)病毒Ⅱ型和豬藍(lán)耳病病毒混合感染。但剖檢時(shí)藍(lán)耳病癥狀相對(duì)較輕，根據(jù)該豬場(chǎng)既往病史，認(rèn)定為隱形帶毒狀態(tài)的僵豬。剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)腸壁增厚，小腸腸粘膜有褶皺，懷疑亦有豬慢性增生性腸炎混合感染，但細(xì)菌學(xué)檢查后未發(fā)現(xiàn)致病菌感染。

3 討論

3.1豬圓環(huán)病毒Ⅱ型感染一般會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)病變，有不同程度的出血。腎臟出現(xiàn)病變，腎臟腫大、出血、有灰白色斑。脾臟病變，現(xiàn)為腫大、邊緣出血，有少部分不發(fā)生腫大、質(zhì)地變脆。胸腹水和彌漫性肺炎也是觀察到的重要病理變化，病例可見(jiàn)肝臟花斑狀條紋，腸或結(jié)腸黏膜充血、淤斑[6]。

3.2豬藍(lán)耳病毒感染主要為各年齡的豬淋巴結(jié)腫大灰白色與肌肉灰白水腫，出血性肺炎和間質(zhì)性肺炎。組織學(xué)變化，支氣管上皮細(xì)胞纖毛的套管樣脫落，肺巨噬細(xì)胞的活化增生。

3.3目前一般認(rèn)為，PRRSV與PCV-2單獨(dú)感染均不會(huì)導(dǎo)致豬大批發(fā)病死亡，但是它們常常混合感染，或與其他病原混合感染會(huì)導(dǎo)致死亡率升高，危害較大。因PCV-2與PRRSV均會(huì)使動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能下降，如有繼發(fā)感染會(huì)造成大批仔豬死亡，經(jīng)濟(jì)損失較大， 故應(yīng)采取綜合防制措施[7]。豬圓環(huán)病毒病與高致病性豬藍(lán)耳病都是一種免疫抑制疾病，病原可破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體抗病力降低。 PCV-Ⅱ經(jīng)常與PRRSV、豬偽狂犬病毒、副嗜血桿菌等病原發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，如果豬場(chǎng)發(fā)病后，疫情會(huì)更加嚴(yán)重，病死率也大大增加。當(dāng)PCV-Ⅱ與PRRSV同時(shí)感染時(shí)，PRRSV可以促進(jìn)PCV-Ⅱ在體內(nèi)的增殖。目前對(duì)豬圓環(huán)病毒病的防制主要是使用滅活疫苗對(duì)豬群進(jìn)行免疫預(yù)防，同時(shí)結(jié)合生物安全、飼養(yǎng)管理和藥物預(yù)防等綜合防控措施，已達(dá)到防治該病的目的。

3.4加強(qiáng)飼養(yǎng)管理方面需要飼養(yǎng)場(chǎng)所保持環(huán)境的清潔，保證圈舍的通風(fēng)性能良好，降低氨氣等有毒有害氣體的影響，養(yǎng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)密度要適當(dāng)，不能追求經(jīng)濟(jì)效益而過(guò)度養(yǎng)殖，以免增加PRRSV和PCV-Ⅱ等疾病的發(fā)病概率。對(duì)陽(yáng)性豬圈要進(jìn)行嚴(yán)格、徹底的殺菌消毒，抑制傳染源，以避免病毒感染擴(kuò)大出現(xiàn)較大疫情[8]。