低氧微環(huán)境對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡及HIF-1α 表達的影響

余朝軍，趙遷浩，趙寧輝

（1） 江油市九〇三醫(yī)院神經(jīng)外科，四川江油 621700；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科二病區(qū)功能神經(jīng)外科，云南昆明 650101；3） 昆明市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科，云南昆明 650034）

腫瘤的惡性增殖使其組織內(nèi)耗氧及血管形成不全，導(dǎo)致微環(huán)境含氧量不足，使腫瘤各區(qū)域處于不同低氧微環(huán)境中，研究已發(fā)現(xiàn)包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的大多實體腫瘤均存在著廣泛的缺氧區(qū)域[1]。并且隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加瘤內(nèi)的氧分壓逐漸降低，研究發(fā)現(xiàn)在許多高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在著明顯的缺氧區(qū)域，其生長的局部氧含量甚至低于1%[2]。缺氧微環(huán)境也與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移、血管生成和耐藥性密切相關(guān)[3]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α） 在機體及細胞水平上調(diào)節(jié)低氧適應(yīng)性反應(yīng)和糖酵解速率，是腫瘤細胞適應(yīng)低氧生存增殖的關(guān)鍵因素[4]。本研究通過三氣培養(yǎng)箱模擬神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的低氧微環(huán)境，觀察處于缺氧環(huán)境的人腦膠質(zhì)瘤細胞株T98G 隨時間變化的生長情況，以及細胞不同生長時間及密度對HIF-1α 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

將人腦膠質(zhì)瘤細胞株T98G（購于中國科學(xué)院昆明動物研究所），用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/高糖+10%FBS+1%P/S） 培養(yǎng)，設(shè)為常氧組（21%O2）和低氧組（1%O2）。以不同密度將低氧組細胞分為低密度組（1 萬個/cm2），中密度組（4.3 萬個/cm2），高密度組（8.5 萬個/cm2） 和極高密度組（12.5 萬個/cm2），于CO2培養(yǎng)箱及三氣培養(yǎng)箱中以相應(yīng)氧濃度及培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72、96及120 h 后檢測細胞存活與增殖。

1.2 MTT 實驗檢測細胞存活及增殖

取對數(shù)生長期的T98G 細胞，設(shè)置常氧組（21%O2）、低氧組（1%O2） 及調(diào)零組，以每孔3 000 個細胞/200 μL 的密度鋪于96 孔板，按分組分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 后進行加入20 μL 0.5 mg/mL MTT 溶液進行增殖檢測。在酶標儀上于492 nm 波長處讀取吸光度值（A 值），以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，實驗重復(fù)3 次。

1.3 Hoechst 染色凋亡檢測

根據(jù)實驗分組，以每孔0.8×105細胞密度接種到6 孔板中，達到處理時間后消化細胞，清洗后以1 mL 4%PFA 重懸、固定細胞，避光下向每孔加1 mL 終濃度為10 μg/mL 的Hoechst33342 染液后滴于載玻片后到熒光顯微鏡觀察。

1.4 HIF-1α 的表達檢測

根據(jù)不同的實驗組，提取各組相應(yīng)時間段的細胞總蛋白后用Western blot 檢測HIF-1α 表達。蛋白質(zhì)濃度測定后，各組樣本取總蛋白20 μg 上樣進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入HIF-1α 一抗過夜，以β-actin 做內(nèi)參，洗膜后加入二抗，顯影曝光后用image J 進行灰度值分析。

1.5 免疫細胞化學(xué)（ICC）

根據(jù)實驗分組在帶有細胞爬片的6 孔板中鋪上密度為0.8×105/孔的T98G 細胞進行處理，達到處理時間后，用4%的多聚甲醛進行細胞固定后室溫下加入密封液（0.5%TritonX-100+3%BSA+5%山羊血清） 處理1.5 h。棄封閉液，加一抗（HIF-1alpha Rabbit Monoclonal Antibody，1:200） 室溫孵育2 h，加二抗（Goat anti-rabbit IgG-FITC，1:200） 室溫孵育1 h，DAPI 液染色10 min；取出玻片，樹膠封片；上熒光顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Hoechst 染色檢測低氧組與常氧組細胞凋亡

倒置顯微鏡下的低氧組T98G 細胞（圖1A）和常氧組細胞（圖1B） 的比較顯示良好的生長狀態(tài)且無明顯的細胞凋亡；Hoechst33342 進行細胞核染色后見低氧組（圖1C） 和常氧組（圖1D） 核形態(tài)完好，未見明顯的細胞凋亡。

圖1 1%O2 氧濃度和常氧下培養(yǎng)72 h 細胞鏡下形態(tài)Fig.1 Cells cultured under 1%O2 oxygen concentration and normoxia for 72 h

2.2 MTT 法檢測低氧組和常氧組的細胞增殖

常氧組和低氧組T98G 細胞連續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 生長曲線發(fā)現(xiàn)（圖2）：常氧組和缺氧組細胞均表現(xiàn)出增殖趨勢且表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)。低氧組在＜72 h 時增殖速率略高于常氧組，但在120 h 內(nèi)生長趨勢差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 T98G 低氧組和常氧組細胞生長曲線Fig.2 Growth curve of T98G cells in hypoxia group and normoxia group

2.3 低氧對T98G 細胞HIF-1α 蛋白表達的影響

T98G 細胞在低氧和常氧下處理24 h 后，根據(jù)免疫熒光結(jié)果，常氧下T98G 細胞中HIF-1α 少量表達（圖3 A），而低氧下呈現(xiàn)高表達（圖3 B）。Western blot 也證實了常氧下HIF-1α 蛋白少量表達（圖4 A），低氧時HIF-1α 蛋白明顯高表達（P＜0.001），見圖4 B。

2.4 不同時間梯度下低氧條件對HIF-1α 表達的影響

根據(jù)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，低氧條件下T98G 細胞的HIF-1α 表達在＜24 h（4、6 和12 h） 隨時間增加（P＜0.05） （圖5A、5B），在24 h（48、72 h） 后隨著時間延長，HIF-1α 表達量逐漸下降（（P＜0.05） 圖5 C、5D）。該結(jié)果還證明了在缺氧條件下HIF-1α 不會長時間大量表達，而是急性快速表達。

圖3 T98G 細胞在低氧和常氧下處理24 h 后HIF-1α 免疫熒光檢測Fig.3 Immunofluorescence detection of HIF-1α in T98G cells treated with hypoxia and normoxic for 24 h

圖4 T98G 細胞在低氧和常氧下處理24 h 后Western blot 檢測HIF-1α 表達水平Fig.4 HIF-1α expression level of T98G cells by Western blot 24 h after hypoxic and normoxic treatment

圖5 T98G 細胞在低氧條件下不同時間段（4、6、12、24、48、72 h） HIF-1α 的表達水平Fig.5 HIF-1α expression in T98G cells at 4 h，6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h under hypoxia

2.5 低氧條件下不同細胞密度對HIF-1α 表達的影響

根據(jù)Western blot 結(jié)果提示（圖6）：低氧下T98 G 細胞中HIF-1α 的表達會受到細胞密度變化的影響，其中在高細胞密度（8.5 萬/cm2，其細胞匯合度約為95%） 表達量最高，密度過高或過低HIF-1α 蛋白表達均會降低。

圖6 Western blot 檢測低氧下不同T98G 細胞密度對HIF-1α 表達的影響Fig.6 Effect of different T98G cell densities on HIF-1α expression under hypoxia by Western blot

3 討論

如同大多數(shù)實體腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤的生長速度遠快于腫瘤血管的生成速度，導(dǎo)致腫瘤細胞局部微環(huán)境中氧含量及營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏[5]。在氧含量及營養(yǎng)不足的情況下，低氧誘導(dǎo)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，使腫瘤細胞得以在缺氧微環(huán)境中保持存活并增殖[6]。目前膠質(zhì)瘤的缺血、缺氧和再復(fù)氧體內(nèi)外模型能充分模擬細胞生長的低氧微環(huán)境，本研究在三氣培養(yǎng)箱中通過調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞株T98G 的培養(yǎng)氧濃度從而觀察其生長反應(yīng)。

局部缺氧導(dǎo)致的一系列鏈式反應(yīng)是造成腫瘤惡性發(fā)展和治療抵抗的重要原因。多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM） 通過快速表低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）激活一系列適應(yīng)性分子機制，以應(yīng)對細胞中氧環(huán)境的變化[7]。HIF 是由一個結(jié)構(gòu)型表達的HIF-1β 亞基和一個O2調(diào)節(jié)亞基（HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α） 構(gòu)成的異源二聚體，在組織處于低氧時HIF-1α 不發(fā)生降解并與β 亞基配合構(gòu)成功能轉(zhuǎn)錄因子[8]。在基因水平上HIF-1α 是氧敏感轉(zhuǎn)錄激活因子，通過結(jié)合靶基因啟動子內(nèi)的DNA 共有序列（缺氧應(yīng)答元件HRE） 而發(fā)生反式激活，HIF-1α 的激活會促進參與細胞自主及非自主適應(yīng)缺氧的數(shù)百種基因發(fā)生表達[9]。即使微環(huán)境中氧含量正常時，HIF-1α 也經(jīng)常通過癌基因激活和/或抑癌基因抑制在癌細胞中被激活[10]。研究證明HIF-1α 在GBM 的發(fā)展和進展中起著關(guān)鍵作用，調(diào)控細胞血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等癌變過程中所涉及的許多基因[11]。

缺氧激活HIF-1α 的表達可導(dǎo)致糖酵解的氧化磷酸化（OXPHOS） 轉(zhuǎn)向無氧糖酵解的基因發(fā)生改變，這種轉(zhuǎn)變也是GBM 的代謝特點[12]。缺氧時HIF-1 通過降低線粒體功能，減少電子傳遞鏈的電子泄漏，防止ROS 的過度產(chǎn)生，以確保GBM細胞在缺氧環(huán)境中的存活并增殖[13]。因此，HIF-1α 在控制GBM 有氧糖酵解以滿足其高能量消耗的同時，還在防止缺氧所致的損傷方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。HIF-1α 的穩(wěn)定表達引發(fā)與無氧糖酵解相關(guān)的一系列酶增多，導(dǎo)致周圍組織乳酸水平升高、細胞外環(huán)境酸化，進一步激活與腫瘤增殖相關(guān)的信號通路[14]。致癌信號通路的激活在轉(zhuǎn)錄水平上促進了HIF-1α 表達[15]。依據(jù)GBM 偏愛糖酵解作為能量代謝的特點，靶向HIF-1α 的研究可能為膠質(zhì)瘤的治療提供機會?；谏鲜鲈?，本實驗通過三氣培養(yǎng)箱來檢測T98G 細胞在1%O2的低氧濃度下的增殖與凋亡情況。通過實驗觀察到缺氧（1%O2）培養(yǎng)環(huán)境不能誘導(dǎo)T98G 細胞發(fā)生明顯的凋亡；在低氧微環(huán)境（1% O2） 中，T98G 細胞HIF-1α 的蛋白表達不是恒定不變的，其表達量與缺氧時間及細胞密度密切相關(guān)。

綜上所述，通過本研究可以初步推斷缺氧微環(huán)境對腦膠質(zhì)瘤T98G 細胞增殖、凋亡的影響，以及不同細胞生長階段和生長密度對HIF-1α 表達的影響。低氧環(huán)境對膠質(zhì)瘤細胞的影響尚需更多研究證明，HIF-1α 的研究能進一步闡明其代謝途徑和調(diào)控凋亡對膠質(zhì)瘤細胞的作用機制，促進以HIF-1α 為靶點的GBM治療研究。