牡丹廢棄物用于制備發(fā)酵可利用還原糖的研究

王軍華，張翔，王易芬，張彥昊，辛雪，陳蕾蕾，趙雙枝

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所／山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室／農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100）

牡丹是我國特有的木本花卉和藥用植物，自2011年中國政府批準(zhǔn)牡丹籽油作為一種新的食品資源以來，每年都有大量的牡丹籽被采集作為生產(chǎn)油脂的原料［1，2］。但在采收牡丹種子的同時，往往會有枝、葉、果莢等摻雜其中，通常在晾曬后再進行分離去除，因此牡丹籽油生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量的廢棄物，這些廢棄物或者被作為低值柴薪，或者被大量丟棄影響生態(tài)環(huán)境［3，4］。

目前關(guān)于牡丹廢棄物的研究較少，主要集中于牡丹果莢中有效成分的提取，如抗氧化活性物質(zhì)［5］、白藜蘆醇［6］、黃酮類化合物［1］以及多糖［3，4］等，而對其中豐富的纖維素鮮少關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)，牡丹的葉、果莢、枝中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量在44%～72%之間，含量較高［7］。有研究證明，一些木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量高的生物材料如雜交楊木、柳枝稷、玉米淀粉、餐廚垃圾等，可經(jīng)處理后制備發(fā)酵可利用還原糖，再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化制備高附加值產(chǎn)品，如生物燃料、可降解生物塑料等［8-10］。因此，本研究對牡丹籽油生產(chǎn)中廢棄物的木質(zhì)纖維素組成和制備發(fā)酵可利用還原糖的方法和產(chǎn)量進行研究，以期開拓牡丹廢棄物的新功能，開辟新的應(yīng)用途徑，同時解決其棄置帶來的環(huán)境污染和資源浪費問題，從而完善牡丹產(chǎn)業(yè)鏈條，為促進牡丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

牡丹（Paeonia ostii）枝、果莢、葉均采自山東菏澤牡丹示范基地，晾干后分開收集，經(jīng)微型植物試樣粉碎機（FZ102，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）粉碎后過60～80目篩，自封袋分別分裝，陰涼干燥處保存。纖維素酶（Aspergillus niger，1.4 U／mg），購于Sigma-Aldrich；其他化學(xué)試劑為市售分析純試劑。

1.2 牡丹廢棄物中木質(zhì)纖維素組分分析

1.2.1 木質(zhì)纖維素含量分析 將粉碎后的牡丹枝、果莢、葉樣品，在（105±2）℃下干燥至恒重后測定其木質(zhì)纖維素含量。酸性洗滌纖維（ADF）測定參照NYT 1459—2007；中性洗滌纖維（NDF）測定參照GB／T 20806—2006；酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）測定參照GB／T 20805—2006。

根據(jù)以下公式計算樣品中的木質(zhì)纖維素含量［11］：

半纖維素（%）＝NDF（%）-ADF（%） ；纖維素＝ADF（%）-經(jīng)72%硫酸處理后的殘渣（%） ；

ADL（%）＝經(jīng)72%硫酸處理后的殘渣（%）-灰化后的灰分（硅酸鹽，%） 。

1.2.2 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜分析 取0.1 g樣品，經(jīng)KBr壓片，使用Bruker vertex 70（德國布魯克公司）近紅外光譜分析儀，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，每個樣品掃描32次。

1.3 牡丹廢棄物預(yù)處理及其效果分析

1.3.1 原材料的預(yù)處理 設(shè)置微波-堿法和水浴-堿法兩種方法對原材料進行預(yù)處理，以篩選還原糖產(chǎn)量高的預(yù)處理方法。取3.0 g樣品，加入2%（m／v）的NaOH溶液30 mL，室溫放置溶脹1 h，然后分別采用微波和水浴加熱處理1 h：①以896 MHz、20 kW 的微波源進行加熱預(yù)處理（由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院食品熱加工工程技術(shù)研究中心提供設(shè)備和技術(shù)支持），溫度（90±3）℃；②水浴加熱，溫度（90±1）℃。

預(yù)處理結(jié)束后用布氏漏斗趁熱過濾，上清液留待GC-MS分析；濾渣用熱水清洗至中性，通風(fēng)干燥至少72 h，再粉碎過60～80目篩使樣品均勻，以備FTIR分析和還原糖制備。

1.3.2 原材料預(yù)處理效果的GC-MS和FTIR分析 （1）氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析：利用7890氣相色譜儀串聯(lián)5977四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），選用HP-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）對預(yù)處理樣品的上清液進行成分分析。初始溫度40℃，保持4 min，然后以3℃／min的速度上升至250℃，保持20 min；進樣口250℃，分流比30∶1；載氣（He）流速1.0 mL／min。電子電離源，轟擊能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，全掃描模式，m／z 35～350。

（2）FTIR分析：取0.1 g預(yù)處理后的樣品，參考1.2.2所述方法進行FTIR分析。

1.3.3 還原糖制備及含量測定 采用纖維素酶解法制備還原糖：稱取0.2 g預(yù)處理后的樣品，加入10 mL檸檬酸鈉緩沖溶液（50 mmol／L，pH 4.8），加入200 U纖維素酶，使酶的終濃度達(dá)到1 000 U／g，在50℃、180 r／min條件下酶解36 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴10 min滅活纖維素酶，10 000 r／min離心2 min，取上清用于還原糖含量測定。

參考文獻［12］的方法，以葡萄糖為對照，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制5.20 mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL離心管中，分別加入100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、0μL雙蒸水，然后加入150μL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻后加1 750μL雙蒸水至總體積2 mL，測定540 nm處吸光度值OD540。以不加葡萄糖的處理組為空白對照，扣除本底，以葡萄糖濃度（mg／mL）為橫坐標(biāo)、OD540為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取酶解反應(yīng)后的上清液，稀釋至適當(dāng)濃度，加入150μL DNS試劑，按照上述方法測定OD540，扣除本底，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶解后的還原糖濃度CR。

CR＝C0×n，其中C0為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的還原糖濃度，n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010軟件進行統(tǒng)計，利用SPSS 22.0軟件采用Duncan’s法進行0.05水平的顯著性分析。方差分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹不同部位廢棄物中木質(zhì)纖維素組成分析

牡丹枝中的木質(zhì)纖維素（木質(zhì)素、半纖維素、纖維素）含量最高，達(dá)72.84%，葉和果莢中的含量相當(dāng)；枝中的綜纖維素（半纖維素、纖維素）含量最高（56.09%），遠(yuǎn)高于葉（36.19%）和果莢（40.00%）（表1）。

表1 牡丹不同部位廢棄物中的木質(zhì)纖維素組成 （%）

對木質(zhì)材料的近紅外光譜研究顯示，所有木材樣本均會出現(xiàn)以下吸收峰：在3 400 cm-1附近和2 900 cm-1附近出現(xiàn)顯著的峰型，在1 750～1 000 cm-1的廣泛吸收范圍內(nèi)涵蓋許多離散峰［13］。本研究對牡丹葉、果莢、枝三個部位的FTIR分析結(jié)果也顯示，在上述相應(yīng)位置同樣出現(xiàn)這些主要特征峰，僅有部分收縮振動峰的位置和峰型存在差異（表2）。

在1 512～1 515 cm-1和1 238～1 245 cm-1的峰位是表征木質(zhì)素的主要吸收峰，其中，1 238～1 245 cm-1附近的峰是表征木質(zhì)素中愈創(chuàng)木基的特征峰；1 512～1 515 cm-1峰位的吸收峰是木質(zhì)素芳香環(huán)碳骨架振動產(chǎn)生的，有研究顯示吸收峰位置高于1 509 cm-1的木質(zhì)素以愈創(chuàng)木基為主［14］，表明，牡丹中主要為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素。牡丹枝中這兩個特征峰的強度更為顯著（圖1），表明牡丹枝中的木質(zhì)素含量更高，這與含量測定結(jié)果一致。

表2 牡丹不同部位的紅外光譜吸收峰歸屬

1 319～1 334 cm-1峰位的特征峰和1 106～1 108 cm-1峰位的吸收峰是木質(zhì)素中紫丁香基結(jié)構(gòu)單元的特征表達(dá)，從牡丹枝和果莢的紅外圖譜中檢出了這兩個峰，表明牡丹枝和果莢中也含有一定量的紫丁香基木質(zhì)素。

另外，牡丹不同部位在1 726～1 736 cm-1峰位的吸收峰在位置和強度上存在較大差異（圖1）。有研究顯示，該位置的吸收峰與纖維素和木質(zhì)素的相對含量有關(guān)，兩者占比越大，該吸收峰就越向波數(shù)低的位置移動［13，15］。由此可以得出牡丹果莢中纖維素和木質(zhì)素的相對含量最高，其次為葉和枝。這與前述牡丹木質(zhì)纖維素組成分析結(jié)果中的纖維素和木質(zhì)素含量是枝＞葉＞果莢相反，造成這種現(xiàn)象的原因還需深入研究。

2.2 預(yù)處理樣品的GC-MS分析

GC-MS分析結(jié)果表明，牡丹不同部位經(jīng)不同預(yù)處理方式處理所得上清液中的物質(zhì)數(shù)量和種類有差異。

牡丹葉經(jīng)兩種方法預(yù)處理后的上清液檢出物質(zhì)種類差異較大，水浴加熱處理檢出6種物質(zhì)，微波加熱處理則檢出16種物質(zhì)，都檢出苯基乙烯衍生物和草酸衍生物；此外，微波加熱處理葉的上清液中還檢出酚結(jié)構(gòu)類似物（甲氧基苯丙胺、二甲基苯氧基取代乙胺、氨甲基甲酸苯酯、硝基甲氧基取代苯基乙烯）。而牡丹果莢和枝經(jīng)兩種方法預(yù)處理后上清液中檢出的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量相似，但種類不同。水浴-堿法和微波-堿法預(yù)處理果莢上清液中分別檢出了14種和15種成分，均檢出了甲醇、去甲偽麻黃堿、乙酸、1-羥基-2-丙酮、丁內(nèi)酯、2-羥基桉葉素、D-甘露糖7種成分；在牡丹枝的兩種預(yù)處理上清液中都檢出了12種成分，均包括甲醇、草酸乙烯酯、2-呋喃甲醇、苯丙胺和苯基乙烯衍生物5種成分。

2.3 預(yù)處理樣品的FTIR分析

FTIR分析結(jié)果（圖2）顯示，微波-堿法和水浴-堿法處理后的牡丹三個部位樣品的光譜形狀和出峰位置基本相似，表明這兩種預(yù)處理方式對不同原材料的處理效果沒有顯著差異；而與未經(jīng)預(yù)處理的原料相比，在1 726～1 736 cm-1以及1 238～1 245 cm-1附近的木質(zhì)素特征吸收峰，強度顯著減弱，證明堿預(yù)處理確實可有效移除木質(zhì)素；同時，1 512 cm-1的吸收峰峰型未發(fā)生顯著變化，但從1 512 cm-1位移到1 508 cm-1附近，上述結(jié)果均表明愈創(chuàng)木基發(fā)生破壞。此外，牡丹果莢和枝的光譜圖中，1 319～1 320 cm-1處的吸收峰未發(fā)生變化，表明這些預(yù)處理手段可能并不能有效破壞紫丁香基。預(yù)處理樣品在1 376 cm-1左右的峰，芳香環(huán)骨架振動和C-H鍵平面內(nèi)拉伸的峰值減弱，表明預(yù)處理對半纖維素的化學(xué)鍵也造成了損傷；3 400、2 900 cm-1以及1 420 cm-1附近的吸收峰與纖維素的O-H拉伸、C-H拉伸和芳香環(huán)骨架伸縮振動有關(guān)，峰強度未發(fā)生明顯變化，這意味著堿預(yù)處理未破壞纖維素［18］。

2.4 發(fā)酵可利用還原糖的產(chǎn)量

本研究結(jié)果（圖3）顯示，葡萄糖濃度在0.52～5.20 mg／mL范圍內(nèi)，OD540（y）與濃度（x）呈線性相關(guān)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.223x＋0.114，R2＝0.988。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出牡丹不同部位（葉、果莢、枝）的還原糖含量。由表3可見，果莢和枝還原糖產(chǎn)量不同預(yù)處理間沒有顯著差異；但微波處理的牡丹葉還原糖產(chǎn)量較水浴處理提高41.30%；兩種預(yù)處理方式中，果莢還原糖產(chǎn)量較葉和枝提高了46.62%～110.92%。

表3 不同預(yù)處理方式的牡丹不同部位廢棄物還原糖產(chǎn)量 （mg／mL）

3 討論與結(jié)論

傅里葉變換紅外（FTIR）光譜主要用于研究分子結(jié)構(gòu)與紅外吸收譜線的關(guān)系，也被廣泛用于木材結(jié)構(gòu)與化學(xué)成分的研究［17］，雖然基團的吸收振動峰位置會因具體化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同有些許差異，但仍會出現(xiàn)在特定的區(qū)域，因此，對紅外吸收峰進行歸屬，對于木質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析和成分的判斷有重要意義。本研究結(jié)果表明，牡丹葉、果莢和枝中含有豐富的纖維素，綜纖維素含量在36.19% ～56.09%之間，牡丹枝中含量最高；FTIR分析顯示其木質(zhì)素為SG型（即紫丁香基和愈創(chuàng)木基木質(zhì)素），以愈創(chuàng)木基木質(zhì)素為主，并確證牡丹枝中的木質(zhì)素含量最為豐富。

堿性溶液被證實可有效去除木質(zhì)素而不降解碳水化合物［19］，而且較高濃度的NaOH（1.0%、1.5%和2.0%）預(yù)處理可有效提高還原糖產(chǎn)量［20］。因此，本研究選擇2%的氫氧化鈉溶液（m／v）用于有效移除木質(zhì)素。微波預(yù)處理可以縮短反應(yīng)時間，加快產(chǎn)物形成，降低反應(yīng)活化能［21，22］。本研究即對比分析了微波-堿法和水浴-堿法對牡丹枝、葉、果莢進行預(yù)處理的效果。經(jīng)FTIR分析，預(yù)處理能有效破壞愈創(chuàng)木基、部分半纖維素，而不破壞纖維素，但是兩種預(yù)處理方式的FTIR峰型沒有明顯差別，表明兩種預(yù)處理方式對木質(zhì)纖維素的破壞作用差異不明顯。對小麥秸稈的研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素分解可產(chǎn)生羧酸衍生物，木質(zhì)素降解則產(chǎn)生單酚類衍生物［23］。本研究中GC-MS在預(yù)處理葉的上清液中檢出這兩種成分，與FTIR分析結(jié)果一致，表明木質(zhì)素和半纖維素被破壞，尤其是微波-堿法預(yù)處理上清中檢出酚結(jié)構(gòu)類似物，表明微波-堿法對葉的木質(zhì)素破壞作用更為明顯；同時，還原糖產(chǎn)量分析結(jié)果顯示，牡丹葉的微波預(yù)處理組還原糖產(chǎn)量是水浴預(yù)處理組的1.41倍，差異達(dá)顯著水平；結(jié)合GC-MS分析結(jié)果，牡丹葉微波-堿法預(yù)處理后的上清液中檢出16種化合物，遠(yuǎn)高于水浴-堿法預(yù)處理（6種），這可能是因為堿性預(yù)處理能有效去除牡丹葉中的可溶性成分，間接提高綜纖維素的相對含量，導(dǎo)致其產(chǎn)糖量較水浴-堿法預(yù)處理的產(chǎn)糖量更高。

此外，D-甘露糖是半纖維素的單糖組成單元［24］，GC-MS在預(yù)處理牡丹果莢的上清液中同時檢出乙酸和D-甘露糖，均證明半纖維素被破壞。至于還原糖產(chǎn)量，在牡丹果莢和枝中，不同預(yù)處理的還原糖濃度沒有顯著差異，但果莢的還原糖產(chǎn)量要顯著高于葉和枝的。牡丹枝中的綜纖維素含量最高，但還原糖產(chǎn)量卻不及果莢。有研究表明，木質(zhì)素填充于纖維素和半纖維素之間，阻礙纖維素酶的酶解效果，而堿預(yù)處理可有效移除部分木質(zhì)素，促進纖維素酶與底物相互接觸［25］；另外，木質(zhì)素的組成和結(jié)構(gòu)也是影響發(fā)酵產(chǎn)糖效果的重要因素，原材料中的木質(zhì)素含量越低，作為底物的生物利用性越好，纖維素酶解產(chǎn)糖量越高。牡丹枝中含有大量的木質(zhì)素，堿預(yù)處理雖能有效去除木質(zhì)素的愈創(chuàng)木基，但可能未有效破壞紫丁香基，這可能干擾了纖維素酶對纖維素的水解作用，最終導(dǎo)致其還原糖產(chǎn)量比牡丹果莢中的低。

綜上，牡丹不同部位廢棄物經(jīng)過預(yù)處理都可用于制備發(fā)酵可利用還原糖，其中牡丹果莢的還原糖產(chǎn)量最高，較葉和枝提高了46.62%～110.92%；微波-堿法預(yù)處理較水浴-堿法預(yù)處理提高了牡丹三個部位材料的還原糖產(chǎn)量，對葉的還原糖產(chǎn)量影響顯著，但對果莢和枝的還原糖產(chǎn)量影響不顯著，因此，從簡便且經(jīng)濟有效的角度考慮，水浴-堿法預(yù)處理可滿足對牡丹廢棄物預(yù)處理的要求，可用于后續(xù)的發(fā)酵還原糖制備。此外，本研究還使用FTIR結(jié)合GC-MS分析，從影響纖維素酶解的木質(zhì)素移除效果和檢出成分兩方面，對兩種預(yù)處理方法的處理效果進行深入探究，闡述了還原糖產(chǎn)量存在差異的內(nèi)在因素。該研究為牡丹廢棄物中木質(zhì)纖維素的應(yīng)用研究提供了有效的分析手段和數(shù)據(jù)，為制備發(fā)酵還原糖提供了有效原材料，為牡丹籽油生產(chǎn)過程中的廢棄物再利用提供新思路，有效解決其棄置帶來的環(huán)境危害和資源浪費。