環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜禽病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用及進(jìn)展

李璐璐，張慶，駱延波，張印，胡明，趙效南，齊靜，劉玉慶

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所／山東省畜禽疫病防控與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

近年來，食源性致病菌引發(fā)的食品安全問題對(duì)人類健康和社會(huì)安全造成了很大威脅。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)由日本學(xué)者Notomi等創(chuàng)建，首次報(bào)道于2000年，它利用識(shí)別多區(qū)域特異性引物組和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右等溫條件下1 h內(nèi)能擴(kuò)增出高達(dá)109拷貝的靶序列［1，2］。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法大多耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)儀器設(shè)備要求較高，不能夠在臨床快速檢測(cè)中普及使用。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，LAMP能滿足快速檢測(cè)的需要。

目前，LAMP方法已經(jīng)在食品安全檢測(cè)［3］、快速檢測(cè)食源性致病菌［4］和水產(chǎn)病害［5］等方面廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立的LAMP方法在畜禽業(yè)常見病原微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用等進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，旨在為該技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用和推廣提供參考。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)概況

LAMP的基本原理是在目的雙鏈DNA解鏈后，內(nèi)外引物識(shí)別相應(yīng)的位點(diǎn)，在Bst DNA聚合酶作用下延伸。當(dāng)外引物延伸至內(nèi)引物處時(shí)可以將內(nèi)引物形成的鏈置換出來，而后形成啞鈴樣的DNA結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)再不斷被引物識(shí)別、延伸和擴(kuò)增，最終形成一系列大小不一的結(jié)構(gòu)［6］。結(jié)果能夠通過肉眼直接觀察是否具有白色焦磷酸鎂沉淀從而進(jìn)行判斷，也可以添加染料進(jìn)行顯色觀察。根據(jù)這一原理，通常需要根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)4～6條引物，隨后加入Bst DNA聚合酶在恒溫60～65℃條件下30～60 min完成擴(kuò)增反應(yīng)。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜禽常見病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

陳柱［7］和Hill［8］等分別根據(jù)大腸桿菌的特異性基因malB建立了LAMP方法。陳柱等建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法檢測(cè)大腸桿菌的靈敏度達(dá)16.010 ng／L，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)限相當(dāng)。Hill等則建立了尿液中大腸桿菌的LAMP檢測(cè)方法，此方法不需要對(duì)尿液中大腸桿菌的DNA進(jìn)行提取，可以直接對(duì)尿液樣品進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同時(shí)采用碘化丙啶作為染料，其靈敏度可以達(dá)到10拷貝／反應(yīng)。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）是一種重要的人畜共患病病原菌，可以引起人類水樣腹瀉、出血性腸炎等輕度腸不適，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征、終末期腎病甚至死亡。Wang等［9］根據(jù)O抗原特異性基因wzx或wzy，對(duì)美國(guó)STEC感染的七種血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145和O157）建立了LAMP方法，用于碎牛肉、牛肉片、生菜和菠菜中STEC的快速診斷。Dong等［10］建立了針對(duì)STEC stx1和stx2的多重LAMP方法，此方法主要通過Tm值把stx1和stx2予以區(qū)分，靈敏度達(dá)10 fg／μL。此外，研究者對(duì)STEC中最常見、危害性最大的O157：H7進(jìn)行了多項(xiàng)研究，根據(jù)O157抗原基因rfbE建立了不同的LAMP方法［11-14］，如LAMP實(shí)時(shí)濁度法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-橫向流動(dòng)試紙條（LAMP-LFD）快速檢測(cè)方法；Ravan等［15］根據(jù)O157：H7特有的Z3276基因中特異性的299 bp建立了LAMP方法，這些LAMP方法的靈敏度大多比普通PCR高10 ～100倍。實(shí)時(shí)濁度法主要通過濁度儀實(shí)時(shí)檢測(cè)LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生的白色沉淀，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增全過程的監(jiān)控，從而提高引物篩選的效率［11］。LAMP-LFD則依賴于序列之間的特異性進(jìn)行擴(kuò)增，避免了非特異性擴(kuò)增造成的假陽性，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度。此外，操作者只要將擴(kuò)增產(chǎn)物加入緩沖液中混合均勻，然后將試紙條浸入緩沖液即可，操作簡(jiǎn)便安全［12］。除建立不同的LAMP方法外，不同研究者對(duì)LAMP方法中使用的染料也進(jìn)行了對(duì)比［13，14］。張雪寒等認(rèn)為，SYBR Green和鈣黃綠素相比，鈣黃綠素只有在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，而SYBR Green無論是否發(fā)生LAMP反應(yīng)，只要有擴(kuò)增反應(yīng)即可顯示綠色熒光，大大限制了LAMP方法的廣泛使用［13］。

2010年Song等［16］根據(jù)ipaH基因建立了針對(duì)STEC和侵襲性大腸桿菌（EAEC）的LAMP快速檢測(cè)方法，檢測(cè)限為每反應(yīng)8 cfu。Stratakos等［17］為了快速檢測(cè)和區(qū)分牛肉和牛糞中非致病性大腸桿菌和多細(xì)胞毒性大腸桿菌，針對(duì)大腸桿菌鑒定基因phoA、stx1、stx2建立了多重LAMP。

LAMP在毒力基因的檢測(cè)方面也發(fā)揮了一定的作用。Kogov?ek等［18］針對(duì)家禽中危害性最大的禽致病性大腸桿菌（APEC），根據(jù)三個(gè)毒力基因sitA、traT和ompT建立了LAMP快速檢測(cè)方法，其最低檢測(cè)限為1 000 cfu／mL。Jiang等［19］對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的F5菌毛基因建立了LAMP方法，其最低檢測(cè)限為每管72 cfu，比PCR靈敏度高100倍。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用

沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一。2015年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在評(píng)估22種細(xì)菌、原蟲和病毒制劑對(duì)全世界食源性疾病的危害時(shí)，將沙門氏菌列為首位［20］。世界上第一篇采用LAMP技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的文章發(fā)表于2005年［21］，我國(guó)最早采用LAMP技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的研究發(fā)表于2008年［23］。本研究收集了2005—2019年發(fā)表的關(guān)于沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法的102篇SCI論文，其中有75篇（73.53%）根據(jù)invA基因設(shè)計(jì)LAMP引物；國(guó)內(nèi)26篇已發(fā)表的期刊文章中，20篇（76.92%）根據(jù)invA基因設(shè)計(jì)LAMP檢測(cè)引物。目前，LAMP在檢測(cè)沙門氏菌方面已涉及多個(gè)領(lǐng)域，包括液態(tài)蛋［21，23］、蛋殼［24］、雞蛋制品［25］、克氏螯蝦樣品［26］、肉制品［27］、動(dòng)物飼料［28］、糕點(diǎn)［29］、牛奶［30，31］等。

魯玉霞［32］、Fang［33］等針對(duì)invA基因分別建立了不同的LAMP方法區(qū)分活菌和死菌。魯玉霞等建立了EMA-LAMP方法對(duì)食源性沙門氏菌的活菌和死菌進(jìn)行區(qū)分。EMA（疊氮溴乙錠）是一種只能進(jìn)入具有不完整細(xì)胞膜的死細(xì)胞中的DNA分子核酸染料。死細(xì)胞暴露于EMA 1 min后，EMA就可以滲透細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜與其中的DNA結(jié)合，使其不能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。此方法的檢測(cè)限可以達(dá)到每管10-10g DNA，比EMA-PCR方法靈敏度提高100倍［32］。Fang等［33］建立了PMA-LAMP方法，PMA-LAMP和PMA-qPCR檢測(cè)限均為6.3×102cfu／mL，但在可視化觀測(cè)死細(xì)胞時(shí)，PMA-LAMP比PMA-qPCR的特異性和靈敏度更好。

李佳桐［34］、Srisawat［35］等分別根據(jù)stn基因建立了沙門氏菌的LAMP檢測(cè)方法。李佳桐等建立的LAMP方法的最低檢測(cè)限是10 cfu／mL，比常規(guī)PCR靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí)；Srisawat等建立的LAMP方法的靈敏度為每反應(yīng)1 cell。田楨干等［36］根據(jù)沙門氏菌agfA基因建立了LAMP方法，其靈敏度與RT-PCR方法接近，達(dá)到103cfu／mL，比膠體金檢測(cè)方法靈敏度高100～1 000倍。洪艷等［37］根據(jù)沙門氏菌編碼DNA解旋酶B亞單位的gyrB基因建立了LAMP方法，靈敏度為6.8×101cfu／mL，能檢測(cè)到比PCR低10倍的拷貝數(shù)。孫園園等［38］根據(jù)沙門氏菌高度保守的fimY基因建立了動(dòng)物飼料中沙門氏菌的快速診斷方法，其最低檢出限為6.2 cfu／mL，比PCR方法靈敏度高100倍。

對(duì)于某些種類的沙門氏菌，研究者建立了不同的LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，對(duì)于腸炎沙門氏菌，袁發(fā)滸［39］、張海艷［40］等分別根據(jù)lygD、SEN1393基因建立了LAMP檢測(cè)方法，其中袁發(fā)滸建立的方法中，細(xì)菌培養(yǎng)液檢出限為2.33×101cfu／mL，鮮雞蛋模擬樣品的檢出限為2.67×101cfu／mL；時(shí)建立等［41］根據(jù)豬霍亂沙門氏菌β-半乳糖苷酶lacZ基因，建立了豬霍亂沙門氏菌的LAMP檢測(cè)方法，將細(xì)菌DNA稀釋到10-8仍可檢出，靈敏度是PCR檢測(cè)法的1 000倍。Gong等［42］根據(jù)sefA基因，運(yùn)用LAMP方法快速檢測(cè)肉雞中腸炎沙門氏菌和雞沙門氏菌，對(duì)于腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）的純培養(yǎng)物，LAMP方法的檢測(cè)限為每反應(yīng)4 cfu，污染的雞糞便中LAMP檢測(cè)限是400 cfu。Fan等［43，44］根據(jù)傷寒沙門氏菌特異性標(biāo)記基因STY1607和STY2879，建立了兩種LAMP檢測(cè)方法，方法均比普通RT-PCR方法靈敏度高10倍。

Ravan等［45］根據(jù)prt基因建立了一種LAMPELISA方法，可快速檢測(cè)D群沙門氏菌，檢測(cè)限為每管4 cfu，對(duì)于人工污染的肉樣檢測(cè)限是103cfu／mL，靈敏度比PCR-ELISA高10倍。Okamura等［46，47］分別對(duì)O4型、O9型沙門氏菌建立了LAMP檢測(cè)方法，其檢測(cè)限為103cfu／mL，比PCR方法靈敏度提高100倍。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

金黃色葡萄球菌是污染食物、引起食物中毒的主要病原菌之一，也是造成臨床感染的常見微生物。目前，LAMP方法在金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方面已經(jīng)有了廣泛應(yīng)用，包括食品［48］、豬血［49］、羅 非 魚［50］、牛 乳［51］、試 驗(yàn) 動(dòng) 物［52］、凍 雞肉［53］、糞便［54］等。大多數(shù)金黃色葡萄球菌的LAMP方法依據(jù)nuc基因建立，并且比PCR方法靈敏度高10～100倍。陳歡等［55］根據(jù)nuc基因建立的LAMP-LFD方法靈敏度達(dá)1.0×101copy／μL。蔡克周等［49］根據(jù)金黃色葡萄球菌的femA基因建立的LAMP方法用于豬血中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，其檢測(cè)限為8.7 cfu／mL，靈敏度比PCR方法高1 000倍。徐義剛等［56］根據(jù)金黃色葡萄球菌高度保守的Sa442基因建立的LAMP方法靈敏度為25 cfu／mL，比PCR方法靈敏度高10倍。Wang等［57］為同時(shí)檢測(cè)糞腸球菌和金黃色葡萄球菌，運(yùn)用Ef0027基因和nuc基因，建立了LAMPLFB（LAMP-側(cè)向流生物傳感器）方法，血液樣品經(jīng)過75 min即可判斷結(jié)果，且準(zhǔn)確可靠。Lim等［58］根據(jù)金黃色葡萄球菌arcC基因建立了一種LAMP方法，并且與根據(jù)spa、arcC基因建立的PCR方法進(jìn)行了比對(duì)，LAMP方法檢測(cè)限為2.5 ng／μL和102cfu／mL，PCR方法檢測(cè)限分別為12.5 ng／μL和103cfu／mL。

近年來，金黃色葡萄球菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)重，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA），幾乎對(duì)所有的抗菌藥物均有不同程度的耐藥，成為嚴(yán)重威脅世界公共衛(wèi)生的一個(gè)重大問題。能否快速準(zhǔn)確地確定是否為MRSA感染，以便選擇合適有效的抗菌藥物用于治療，對(duì)于臨床治療非常迫切。Su等［59］根據(jù)orfX基因建立了一種快速檢測(cè)MRSA的LAMP方法，檢測(cè)限為每反應(yīng)10 cfu。Nawattanapaiboon等［60］根據(jù)femB基因和mecA基因建立了LAMP-LFD方法，根據(jù)mecA基因建立的方法檢測(cè)限為10 pg DNA或100 cfu／mL。Chen等［61］根據(jù)mecA、nuc和femB基因建立了一種用于MRSA快速診斷的LAMP方法，并且為了便于肉眼觀察，在反應(yīng)體系中加入了HNB（羥基萘酚藍(lán)）。Lin等［62］則根據(jù)16S rRNA、femA、mecA和orfX建立了LAMP方法，可對(duì)醫(yī)院呼吸道樣本中MRSA進(jìn)行快速診斷，其中利用16S rRNA、femA、mecA基因的檢測(cè)限均為104cfu／mL，利用orfX基因的檢測(cè)限為105cfu／mL。此外，Yin等［63］根據(jù)金黃色葡萄球菌腸毒素基因sea和seb建立了多重LAMP方法，檢測(cè)限為102cfu／mL，比PCR方法靈敏度高10倍；對(duì)經(jīng)過孵育6 h后的牛奶、蘋果汁、奶酪和大米的檢測(cè)限均為1 cfu／mL。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在其他病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用

除了大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌以外，研究者還對(duì)銅綠假單胞菌［64］、副豬嗜血桿菌［65］、豬鏈球菌［66］、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌［67］、李斯特菌［68，69］等建立了不同的LAMP方法。

3 結(jié)語

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種具有突破性的、較為便捷和快速的核酸檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有較高的特異性，且靈敏度比常規(guī)PCR高10～100倍。其突出優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)所需時(shí)間短、無需昂貴的儀器、檢測(cè)結(jié)果可視化。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)和常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等共同成為常規(guī)檢測(cè)的主要工具。但是LAMP技術(shù)也存在一些缺陷。由于LAMP引物設(shè)計(jì)一般針對(duì)靶基因的4～6個(gè)區(qū)域，引物的設(shè)計(jì)比較復(fù)雜且受到限制，同時(shí)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)靶基因的長(zhǎng)度有要求，因此需要人工參與引物設(shè)計(jì)，需要一定的專業(yè)基礎(chǔ)；多個(gè)引物的使用雖然提升了特異性，但同時(shí)也增加了引物之間的雜交概率，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；此外，LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物非常穩(wěn)定，不易降解，易形成氣溶膠污染，且LAMP反應(yīng)的靈敏度極高，即使極少量的陽性產(chǎn)物也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，這就對(duì)操作人員、操作過程提出了較高的要求。

由于LAMP易于適應(yīng)任何現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境，且具有實(shí)時(shí)檢測(cè)所需的所有特性，未來隨著便攜式LAMP產(chǎn)品的進(jìn)一步發(fā)展，以及與其它多種技術(shù)的結(jié)合，LAMP在臨床微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣泛，為基層企業(yè)的病原微生物檢測(cè)提供了有價(jià)值的工具，不僅能夠降低病原微生物的檢測(cè)成本，同時(shí)還能有效地進(jìn)行早期控制，避免更多的經(jīng)濟(jì)損失。因此，LAMP未來的研究、應(yīng)用發(fā)展方向可集中在研發(fā)集成式、體積小、操作便捷、直接檢測(cè)樣本、通量高、易判讀、低費(fèi)用的手持式檢測(cè)儀。