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    溫敏性水凝膠抑制間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡并促進(jìn)旁分泌及過(guò)表達(dá)FTH的細(xì)胞MRI的實(shí)驗(yàn)研究

    2020-08-29 13:39:07賴麗莎郭媛梁瑩瑩胡曉俊盧雄
    新醫(yī)學(xué) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡磁共振成像

    賴麗莎?郭媛?梁瑩瑩?胡曉俊?盧雄

    【摘要】目的 探討過(guò)表達(dá)鐵蛋白重鏈(FTH)的間充質(zhì)干細(xì)胞(UE7T-13)進(jìn)行體外MRI的可行性,并驗(yàn)證溫敏性水凝膠HA-F127復(fù)合UE7T-13是否可抑制其凋亡、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌。方法 構(gòu)建攜帶FTH-綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒載體并感染UE7T-13,檢測(cè)感染后的GFP陽(yáng)性率及FTH表達(dá)水平。同時(shí),HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8法)檢測(cè)FTH慢病毒載體感染后和(或)水凝膠復(fù)合后的UE7T-13細(xì)胞增殖能力,并進(jìn)行HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13的MRI。檢測(cè)HA-F127復(fù)合對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2) 誘導(dǎo)UE7T-13細(xì)胞凋亡的影響,ELISA檢測(cè)IL-10、HGF含量。結(jié)果 FTH-GFP慢病毒載體可成功感染UE7T-13,48 h熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)率幾乎100%,F(xiàn)TH mRNA表達(dá)提高了3倍,F(xiàn)TH蛋白可隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增多并至5 d仍穩(wěn)定高效表達(dá)。FTH感染或HA-F127復(fù)合均不影響UE7T-13增殖能力,不影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外MRI。HA-F127復(fù)合UE7T-13可抑制H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)IL-10、HGF細(xì)胞因子分泌。結(jié)論 過(guò)表達(dá)FTH實(shí)現(xiàn)UE7T-13的MRI示蹤功能,溫敏性水凝膠HA-F127可在過(guò)氧化損傷環(huán)境下抑制FTH/UE7T-13的凋亡,并促進(jìn)其分泌IL-10、HGF,可為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

    【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;鐵蛋白重鏈;水凝膠;磁共振成像;凋亡

    Experimental study of role of thermo-sensitive hydrogel in inhibiting apoptosis and promoting paracrine function of MSC and MRI of MSC overexpressing FTH Lai Lisha, Guo Yuan, Liang Yingying, Hu Xiaojun, Lu Xiong. Department of Radiology, Guangzhou First Peoples Hospital, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510180, China

    Corresponding author, Lu Xiong, E-mail: 122055667@ qq. com

    【Abstract】Objective To explore the feasibility of in-vitro magnetic resonance imaging (MRI) for UE7T-13 overexpressing ferritin heavy chain (FTH), and investigate the role of thermo-sensitive hydrogel (HA-F127) in suppressing apoptosis and promoting paracrine function of UE7T-13. Methods Lentiviral vectors carrying FTH-GFP gene were established and transfected into UE7T-13. The positive rate of GFP expression and FTH expression level in FTH/UE7T-13 cells were evaluated. FTH/UE7T-13 was encapsulated in HA-F127. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) was used to detect the cell proliferation of UE7T-13 after transfection and encapsulation. MRI of the HA-F127-encapsulated FTH/UE7T-13 was performed. The effect of HA-F127 upon the H2O2-induced UE7T-13 apoptosis was evaluated. The contents of IL-10 and HGF were quantitatively measured by using ELISA. Results Lentiviral vectors carrying FTH-GFP gene were successfully transfected into UE7T-13. Fluorescent microscope revealed that the GFP expression rate was almost 100% at 48 hours and the expression level of FTH mRNA was up-regulated by three times. The expression of FTH protein was up-regulated over time and stably expressed for 5 days after transfection. FTH transfection and HA-F127 encapsulation exerted no effect on the proliferation ability of UE7T-13 or the MRI of mesenchymal stem cell. HA-F127 encapsulation could inhibit cell apoptosis induced by H2O2 and promote HGF and IL-10 secretion. Conclusions FTH over-expression can realize in-vitro MRI of UE7T-13. Thermo-sensitive hydrogel HA-F127 encapsulation can inhibit the apoptosis and enhance the HGF and IL-10 secretion of FTH/UE7T-13, which lay a basis for subsequent experiment.

    【Key words】Mesenchymal stem cell;Ferritin heavy chain;Hydrogel;Magnetic resonance;

    Apoptosis

    我國(guó)慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn),每年死于肝纖維化和肝癌的患者高達(dá)50萬(wàn),是全球晚期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)[1]。目前尚無(wú)有效治療肝纖維化的臨床方法,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)被認(rèn)為具有修復(fù)肝纖維化的潛能[2]。前期實(shí)驗(yàn)表明,體內(nèi)微環(huán)境影響MSC存活率,并且缺乏活體監(jiān)測(cè)MSC的有效手段是阻礙MSC治療從基礎(chǔ)研究向臨床移植治療轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[3-4]。本研究擬構(gòu)建可活體MRI顯像的過(guò)表達(dá)鐵蛋白重鏈(FTH)的MSC(FTH/MSC),并體外證實(shí)其可實(shí)現(xiàn)MSC的MRI示蹤功能,同時(shí),通過(guò)構(gòu)建功能化水凝膠(HA-F127)改善細(xì)胞外微環(huán)境,以提高M(jìn)SC的存活率及旁分泌功能,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

    材料與方法

    一、主要試劑和儀器

    DMEM-LG 培養(yǎng)基(GIBCO),F(xiàn)TH基因質(zhì)粒(廣州永諾生物科技有限公司),CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所),HGF、IL-10 ELISA試劑盒(RD公司),兔抗人FTH單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體(武漢博士德公司)。熒光顯微鏡(奧特BDS200-FL),酶標(biāo)儀(Diatek公司),冷凍高速離心機(jī)(Hema TGL-16R),1.5T 磁共振成像儀(Signa Infinity Twinspeed,GE公司)。人永生化骨髓MSC UE7T-13(日本Mori等[5]惠贈(zèng)):5%二氧化碳(CO2),37℃環(huán)境下,低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)(圖1)。

    二、慢病毒載體構(gòu)建、病毒感染及基因表達(dá)檢測(cè)

    通過(guò)PCR進(jìn)行FTH基因和IRES-綠色熒光蛋白(GFP)基因擴(kuò)增,將二者連接后,與慢病毒載體LV003相連,構(gòu)建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體進(jìn)行測(cè)序鑒定;同時(shí)構(gòu)建GFP慢病毒載體作為陰性對(duì)照(FTH/UE7T-13及GFP/UE7T-13)。采用脂質(zhì)體法將重組載體感染人胚腎細(xì)胞293A(HEK-293A)進(jìn)行包裝,檢測(cè)病毒滴度(TU/ml)。

    將5×105 UE7T-13接種至6孔板,感染前更換新鮮培養(yǎng)液,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的最佳感染復(fù)數(shù)(3000 pfu/細(xì)胞)加入病毒液,混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng);于6 h更換新鮮培養(yǎng)液,每隔24 h觀察細(xì)胞狀態(tài)。

    病毒感染后48 h,采用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況;定量PCR(Q-PCR)方法檢測(cè)FTH mRNA水平,引物如下(FTH1-F:GACTCAGAG

    GCCGCCATCAA;FTH1-R:AAGATTCGGCCA CCTCGTTG),使用2-ΔΔCt法[ΔCt = Ct(FTH) -Ct(GAPDH),△△Ct = Ct(FTH/UE7T-13) -Ct(UE7T-13)];采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)FTH慢病毒感染UE7T-13后1、2、3、5 d的FTH蛋白表達(dá)。

    三、體外細(xì)胞MRI

    分別將不同數(shù)量(1×103、1×104、1×105、1× 106、1×107、1×108)FTH/UE7T-13細(xì)胞進(jìn)行體外MRI掃描。掃描方案:1.5 TMR,并采用內(nèi)徑12.7 cm的表面線圈,進(jìn)行SE序列T2W掃描,參數(shù):重復(fù)時(shí)間= 400 ms,回波時(shí)間= 100 ms,帶寬20.83,NEX = 2.0,F(xiàn)OV = 20 cm×20 cm,層厚2 mm,矩陣384×256。

    四、溫敏水凝膠透明質(zhì)酸(HA) -F127的制備、鑒定并復(fù)合FTH/UE7T-13

    稱取0.9 g的普朗尼克(Pluronic)F127分別和0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g 透明質(zhì)酸鈉混合,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%及分別含有不同濃度(1%、2%、2.3%、2.5%、3%、4%、5%)HA-F127溶液,使其可在37℃凝膠,成膠后采用掃描電鏡觀察凝膠(HA-F127)的三維結(jié)構(gòu)。

    收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3 ~ 5代慢病毒感染后UE7T-13,消化、離心后,用未凝固的水凝膠混合液重懸細(xì)胞沉淀,UE7T-13與HA-F127充分混合后,置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),待凝固成膠體后,每孔再添加 200 μl含10%胎牛血清和1% 鏈霉素的 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基。

    細(xì)胞實(shí)驗(yàn)根據(jù)處理情況共分4組:A組(UE7T- 13),未感染的UE7T-13;B組(GFP/UE7T-13),空白載體載GFP感染的UE7T-13;C組(FTH/UE7T-13),F(xiàn)TH慢病毒感染的UE7T-13;D組(GEL-FTH/UE7T-13),HA-F127復(fù)合的FTH/UE7T-13,即凝膠組。

    五、HA-F127復(fù)合及FTH感染對(duì)UE7T-13的成脂成骨分化能力檢測(cè)

    D組(GEL-FTH/UE7T-13)需先放入4℃冰箱中溶解凝膠,凝膠溶解后去除,并使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行清洗,分別向培養(yǎng)板內(nèi)加入成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,分別采用油紅O染色、茜素紅染色,顯微鏡下觀察標(biāo)記后MSC的成脂、成骨分化情況。

    六、CCK-8檢測(cè)HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13的增殖率

    4個(gè)處理組各取5×103個(gè)細(xì)胞,均勻接種于96孔板,于接種后第3日進(jìn)行CCK-8,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,以A組(UE7T-13)作為對(duì)照組,每次每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,取平均值。

    七、HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13抗過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞因子釋放的檢測(cè)

    將C、D組細(xì)胞接種于6孔板,24 h后加入H2O2(50 μmol/L),調(diào)整終濃度為50 μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)12 h;培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞進(jìn)行流式凋亡檢測(cè)。采用ELISA檢測(cè)C組及D組上清液的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、IL-10濃度:分別將2組5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,24 h后加入H2O2(50 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)12 h,取細(xì)胞上清液檢測(cè)HGF、IL-10水平。

    八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以表示。兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。多組比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果

    一、成功構(gòu)建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體并轉(zhuǎn)染UE7T-13

    LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體,并成功感染UE7T-13。感染293A 48 h后,細(xì)胞免疫法檢測(cè)病毒滴度為1×109 TU/ml。FTH慢病毒感染UE7T-13 48 h后熒光顯微鏡下觀察,GFP表達(dá)陽(yáng)性率幾乎100%(圖2A);Q-PCR證實(shí)FTH慢病毒感染UE7T-13 48 h后FTH mRNA表達(dá)水平提高了3倍(P < 0.001);FTH慢病毒感染UE7T-13,F(xiàn)TH蛋白表達(dá)隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)增多。

    二、HA-F127可成功復(fù)合MSC,不影響細(xì)胞增殖能力

    當(dāng)F127濃度為18%,HA濃度為2.3%,HA-F127可在37℃凝固成膠(圖3A)。CCK-8顯示,4組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.809,圖3B)。HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與凝膠化溫度的關(guān)系見表1。

    三、HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13的MRI

    HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13后,利用FTH的T2負(fù)性對(duì)比效應(yīng),可檢測(cè)MSC的T2負(fù)性對(duì)比,在磁共振T2加權(quán)圖像上呈低信號(hào)。并且隨著細(xì)胞數(shù)量的增加,MRI標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低(圖4)。

    四、HA-F127復(fù)合FTH/UE7T-13不影響其成骨成脂分化能力

    水凝膠包裹FTH/UE7T-13洗脫后進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo):①茜素紅染色顯示FTH/UE7T-13大片深紅色化合物,聚集部可見斑片狀橘紅色鈣鹽沉積(圖5A);②油紅O染色顯示FTH/UE7T-13體積增大,胞漿內(nèi)可見串珠狀紅色脂滴(圖5B)。上述證明成骨成脂誘導(dǎo)成功。

    五、HA-F127復(fù)合可抑制UE7T-13凋亡,并促進(jìn)HGF及IL-10的旁分泌

    經(jīng)H2O2處理12 h后,D組細(xì)胞早期凋亡率為5.7%,晚期凋亡率為13.9%,C組細(xì)胞早期凋亡率為7.2%,晚期凋亡率為21.7%,D組細(xì)胞凋亡數(shù)量少于C組(圖6A)。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí),D組的上清液中HGF及IL-10分泌較C組增加(HGF:148.4±15.9 vs. 42.9±3.9,t = -11.1,P < 0.001;IL-10:49.51±5.4 vs. 21.2±2.6,t = -5.7,P = 0.005;圖6B)。

    討論

    干細(xì)胞移植治療終末期肝病越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2]。然而,仍有研究指出MSC移植不能改善,甚至是促進(jìn)肝纖維化,可能是肝纖維化體內(nèi)微環(huán)境導(dǎo)致MSC活性降低或者死亡[6-7]。因此,如何改善移植后微環(huán)境,提高M(jìn)SC存活率及增強(qiáng)旁分泌能力,可能是提高M(jìn)SC移植治療肝纖維化療效的關(guān)鍵。因此本研究采用HA-F127復(fù)合MSC改善細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境,增強(qiáng)MSC在H2O2過(guò)氧化損傷環(huán)境中的存活及旁分泌功能;同時(shí),通過(guò)MRI分子影像技術(shù),實(shí)現(xiàn)MSC的活體示蹤的目的。

    本實(shí)驗(yàn)使用人永生化骨髓MSC(UE7T-13),具有無(wú)限增殖能力并維持良好的細(xì)胞狀態(tài)和功能,且同MSC一樣易于接受外源性基因的導(dǎo)入[5]。本研究選擇FTH的MRI報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)MSC活體示蹤的目的,因?yàn)槠淇衫脙?nèi)源性鐵離子進(jìn)行MRI,不依賴外源性鐵劑,具有相對(duì)更高的MRI靈敏度[8]。細(xì)胞基因?qū)氲霓D(zhuǎn)運(yùn)載體選擇非常重要,本研究選擇慢病毒載體,可將大片段的目的基因整合靶細(xì)胞DNA,并使目的基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá),同時(shí),其引起的免疫反應(yīng)小[9-10]。構(gòu)建的LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒表達(dá)載體感染UE7T-13 48 h后,可同時(shí)表達(dá)FTH和GFP,熒光顯微鏡下可見GFP表達(dá)幾乎達(dá)100%,Q-PCR檢測(cè)提示感染細(xì)胞中FTH mRNA的表達(dá)提高了3倍,蛋白免疫印跡法顯示感染細(xì)胞中FTH可隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增多,并至5 d仍穩(wěn)定高效表達(dá),并被證實(shí)可用于MSC的體外MRI,這為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供成像基礎(chǔ)。

    有研究者指出MSC治療肝纖維化療效欠佳,可能與肝纖維化微環(huán)境中存在的大量炎癥因子,直接導(dǎo)致移植的MSC大量逃逸和死亡有關(guān)[3-4, 6-7]。HA和Pluronic F127制備的水凝膠(HA-F127)不僅具有良好的生物相容性和安全性,還具有溫度敏感性,可用于常溫下注射,并在37℃呈凝膠狀,注射后能夠構(gòu)建MSC移植后生存的微環(huán)境,促進(jìn)其滯留、存活及旁分泌等功能[11-13]。本研究證實(shí),HA-F127在體外不影響FTH/UE7T-13的增殖能力,且不影響MSC的成脂成骨能力。

    在H2O2誘導(dǎo)凋亡情況下,D組細(xì)胞凋亡率低于C組;同時(shí)證實(shí)在過(guò)氧化損傷情況下,D組細(xì)胞上清液中HGF及IL-10分泌較C組明顯增多。上述結(jié)果可能與HA-F127改善細(xì)胞存在的微環(huán)境,促進(jìn)MSC的存活而進(jìn)一步增加其旁分泌功能有關(guān),同時(shí),HGF及IL-10作為抗凋亡及抗炎因子也發(fā)揮了抗過(guò)氧化而減少細(xì)胞損傷作用[14-15]。

    綜上所述,表達(dá)LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒感染UE7T-13后可穩(wěn)定高效表達(dá)FTH,可用于MSC的體外MRI,而且不影響UE7T-13分化增殖能力;同時(shí),HA-F127可通過(guò)改善UE7T-13的微環(huán)境從而抑制MSC凋亡,提高旁分泌能力。該結(jié)果為本課題組進(jìn)一步開展水凝膠復(fù)合MSC治療肝纖維化提供了研究基礎(chǔ)。

    參 考 文 獻(xiàn)

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    (收稿日期:2020-03-18)

    (本文編輯:楊江瑜)

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