38株西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析

王剛 趙燕娟 索朗斯珠 翟新驗(yàn)

摘要：為了解38株西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因亞型流行及耐藥性情況。利用藥敏試驗(yàn)、PCR檢測技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的38株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因菌株進(jìn)行耐藥性分析及耐藥基因研究。ESBLs檢測結(jié)果顯示，在初篩以及確認(rèn)試驗(yàn)中，有21株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為55.3%。基因型檢測結(jié)果表明，38株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌中有34株產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-U，檢出率為89.5%;13株產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-1，檢出率為34.2%;4株產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-9，檢出率為10.5%;30株產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶TEM，檢出率為78.9%;所有菌株均未檢出OXA及SHV基因型。藥敏檢測結(jié)果顯示，38株牦牛源腸產(chǎn)毒素大腸桿菌對(duì)萬古霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、紅霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟等均表現(xiàn)為高度耐藥，對(duì)頭孢噻肟的耐藥率高達(dá)100%;對(duì)氯霉素、諾氟沙星、青霉素、阿奇霉素的耐藥率分別為63.2%、50.0%、86.8%、73.7%;僅對(duì)鏈霉素、丁胺卡那、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢西丁等表現(xiàn)為敏感。說明目前西藏地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌株的確存在，且產(chǎn)ESBLs菌株的基因型以CTX型為主，TEM型次之。ESBLs的產(chǎn)生能明顯增加菌株的耐藥性，提示我們在臨床用藥中，不僅要合理使用抗生素，而且還要注意結(jié)合酶抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：牦牛;大腸桿菌;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;耐藥性;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S855.1+2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0211-04

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的以下痢、全身性敗血癥為主要臨床癥狀的多種病的總稱，此病一年四季均可發(fā)生，以新生犢牛為主[1]。近年來，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的大腸桿菌菌株呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重制約著臨床用藥治療大腸桿菌病的效果，使治療陷入極大困境[2]。ESBLs是β-內(nèi)酰胺酶的最主要酶型，它的產(chǎn)生可水解包括頭孢等三代β-內(nèi)酰胺類藥物，是菌株對(duì)該類藥物產(chǎn)生耐藥的最主要原因[3]。目前，已發(fā)現(xiàn)的ESBLs基因型主要有TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型等[4]。本試驗(yàn)對(duì)臨床分離得到的38株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）進(jìn)行ESBLs基因型檢測，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析，旨在為西藏地區(qū)臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株來源

本試驗(yàn)38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌菌株，均為西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株，編號(hào)為1～38;質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要試劑

PCR試劑、核酸染料4S Red plus等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及鏈霉素、頭孢唑林、青霉素、紅霉素等14種常用抗菌藥物，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6021型真空干燥箱，均購自北京市六一儀器廠;AB204-N型電子分析天平，購自上海醫(yī)用核子儀器廠;SW-CJ-JC超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化設(shè)備公司;CHA-S型往復(fù)空氣恒溫?fù)u床，購自常州金壇良友儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株的復(fù)壯

將實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存的38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌菌株分別接種于裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37 ℃，120 r/min 搖速的搖床中，過夜培養(yǎng)。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的K-B法，其詳細(xì)操作步驟可見參照文獻(xiàn)[5]。抑菌結(jié)果的判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2013等公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感、中介、耐藥等3種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定[6]。

1.2.3 ESBLs的檢測

根據(jù)CLSI推薦的表型篩選和確證試驗(yàn)進(jìn)行操作和判讀[7]。

1.2.4 ESBLs基因型檢測

從GenBank中檢索已登錄的TEM、SHV、CTX-M（CTX-M-U、CTX-M-1、CTX-M-9）、OXA（OXA-1、OXA-2、OXA-10）的基因序列，分別設(shè)計(jì)TEM、SHV、CTX-M、OXA的通用引物，然后采用Primer 5設(shè)計(jì)引物[8-9]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性1 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)30 次;72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌對(duì)14種常用抗生素的藥敏檢測結(jié)果，由表2可知，38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌對(duì)萬古霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、紅霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、氯霉素、諾氟沙星、青霉素和阿奇霉素等均表現(xiàn)為耐藥，其中對(duì)四環(huán)素、頭孢噻肟耐藥率高達(dá)100.0%;所有菌株僅對(duì)丁胺卡那、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢西丁等表現(xiàn)為敏感。

2.2 ESBLs檢測結(jié)果

由圖1可知，38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ESBLs檢測結(jié)果表明，在初篩及確認(rèn)試驗(yàn)中，有21株大腸桿菌檢測為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為55.3%。其中，CFZ檢出6株，檢出率為15.8%，占總陽性株數(shù)的28.6%，CTX檢出21株，檢出率為55.3%，占總陽性株數(shù)的100%，PEN檢出18株，檢出率為47.4%，占總陽性株數(shù)的85.7%，F(xiàn)OX檢出3株，檢出率為7.9%，占總陽性株數(shù)的14.3%。

2.3 ESBLs基因型檢測結(jié)果

由表3可知，38株腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌中有34株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶 CTX-M-U，檢出率為89.5%;有13株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-1， 檢出率為34.2%;有4株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-9，檢出率為10.5%;有30株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌攜帶TEM，檢出率為78.9%;所有菌株均未檢出OXA及SHV基因型。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)38株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌進(jìn)行ESBLs檢測，共檢出21株為產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率為55.3%，本結(jié)果要高于Yum等報(bào)道的28.4%[10]，比苑麗等報(bào)道的76.7%低[2]。據(jù)有關(guān)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在細(xì)菌間快速傳播耐藥基因，這給臨床治療帶來困難，更加說明了加強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶監(jiān)測的迫切性和必要性[11]。

ESBLs基因型檢測結(jié)果表明，目前西藏地區(qū)產(chǎn)ESBLs牦牛源大腸桿菌流行的基因型主要以TEM型和CTX-M型為主，尚未檢測出SHV型。ESBLs基因型與菌株的耐藥表型相關(guān)，TEM的產(chǎn)生可使菌株對(duì)PEN耐藥，而CTX-M的產(chǎn)生對(duì)CTX水解效率更高，耐藥率也隨之增高[2，12]，本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示所有菌株對(duì)青霉素、頭孢噻肟的耐藥率分別為868%、100.0%，產(chǎn)ESBLs菌株中TEM及CTX-M-U的檢出率分別為78.9%、89.5%，這一檢出率高于謝苗苗報(bào)道的檢出率[13]，同時(shí)可以看到本試驗(yàn)中藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因檢出率基本一致，這與TEM主要介導(dǎo)PEN耐藥、CTX-M介導(dǎo)CTX耐藥觀點(diǎn)相一致。本次ESBLs基因型檢測結(jié)果同時(shí)也顯示，產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株耐藥率高于產(chǎn)TEM型ESBLs菌株，并且對(duì)其他種類藥物的耐藥率也高于TEM型ESBLs菌株，這提示臨床中對(duì)CTX-M型耐藥菌株的治療將更加艱難，須引起我們高度警惕。

通過本藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，21株產(chǎn)酶菌對(duì)三代頭孢類抗生素的耐藥率為10.5%～100.0%，并非都是100.0%，即仍存在著部分菌株對(duì)此類藥物表現(xiàn)出體外敏感，但產(chǎn)ESBLs菌株通常表現(xiàn)為體外敏感而體內(nèi)耐藥的特點(diǎn)[14]，因此只用體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果的方法來指導(dǎo)臨床用藥是不全面的。鑒于牦牛源大腸桿菌產(chǎn)酶檢出率較高，因此建議在臨床中應(yīng)用藥敏試驗(yàn)檢測的同時(shí)，也要進(jìn)行ESBLs的檢測，一旦檢測到陽性菌株，則不管藥敏試驗(yàn)結(jié)果如何都應(yīng)視為分離株對(duì)第三代頭孢藥物耐藥[15]。本研究中藥敏試驗(yàn)結(jié)果還顯示，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)除β-內(nèi)酰胺類藥物以外的其他抗菌藥物也同時(shí)存在較高的耐藥率，即在交叉耐藥和多重耐藥現(xiàn)象上表現(xiàn)的要比非產(chǎn)酶菌株嚴(yán)重的多，至于什么原因?qū)е略摤F(xiàn)象的產(chǎn)生尚須通過后續(xù)研究其耐藥機(jī)制來進(jìn)行闡述。

參考文獻(xiàn)：

[1]龐書琴. 犢牛大腸桿菌病的防治[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2018，34（1）：190-191.

[2]苑 麗，劉建華，胡功政，等. 30株雞大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（6）：438-443.

[3]王 鵬. 腸桿菌科細(xì)菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白的研究[D]. 上海：復(fù)旦大學(xué)，2012.

[4]沈莉萍，徐 鋒，張維誼，等. 1997—2010年上海市豬源大腸桿菌耐藥性和產(chǎn)ESBLs菌的基因型檢測[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2017，34（9）：26-30，45.

[5]索朗斯珠，王 剛，羅潤波，等. 西藏牦牛源大腸桿菌主要耐藥表型及耐藥基因檢測[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，37（8）：1501-1506.

[6]貢 嘎，王 剛，拉 珍，等. 西藏牦牛大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2014，50（8）：80-82.

[7]付秀玲，吳 華，陳紅英，等. 禽致病菌ESBLs和AmpC酶的檢測及藥敏分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（2）：217-222.

[8]張青嫻，徐引弟，王治方，等. 河南省豬源大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（12）：2087-2093.

[9]魏 丹. 肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性及產(chǎn)ESBLs的基因型分析[D]. 鄭州：鄭州大學(xué)，2015.

[10]Yum J H，Kim S，Lee H，et al. Emergence and wide dissemination of CTX-M-type ESBLs，and CMY-2- and DHA-1-type AmpC β-lactamases in Korean respiratory isolates of Klebsiella pneumoniae[J]. Journal of Korean Medical Science，2005，20（6）：961-965.

[11]孫 紅. 肺炎克雷伯菌ESBLs檢測和KPC酶分析[D]. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2011.

[12]Palzkill T.Structural and mechanistic basis for extended-spectrum drug-resistance mutations in altering the specificity of TEM，CTX-M，and KPC β-lactamases[J]. Frontiers in Molecular Biosciences，2018，5：16.

[13]謝苗苗. 畜禽肉源大腸桿菌CTX-M型ESBLs的流行狀況及傳播機(jī)制研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[14]高莉莉，劉章平. 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和克雷伯菌的耐藥性分析[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2008，6（4）：9，11.

[15]陳天寶，陳建魁，于 農(nóng)，等. 同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶菌株的表型檢測及其意義[J]. 中國誤診學(xué)雜志，2008，8（24）：5802-5803.

收稿日期：2019-08-31

基金項(xiàng)目：國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-37）;元亨基金項(xiàng)目（編號(hào)：603318017）。

作者簡介：王 剛（1988—），男，河南信陽人，碩士，助教，主要從事高原動(dòng)物傳染病研究。E-mail：1039376778@qq.com。

通信作者：索朗斯珠，博士，教授，主要從事高原動(dòng)物疫病防控研究。E-mail：xzslsz@163.com。