新疆阿魏RNA提取的不同方法比較

劉歡歡 賴曉輝

摘? ? 要：以新疆阿魏葉片為材料，采用3種不同的方法分別提取其總RNA，用核酸蛋白檢測儀、瓊脂糖凝膠電泳方法檢測其濃度、純度及完整性，旨在建立提取新疆阿魏總RNA的最適方法，為后續(xù)深入研究新疆阿魏生物合成途徑及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：3種方法均能提取出新疆阿魏葉片總RNA。試劑盒法提取的總RNA質(zhì)量最好，28S RNA亮度是18S RNA的2倍，條帶清晰，操作簡單，耗時短;Trizol法提取的RNA質(zhì)量次于試劑盒法，且過程中無法判斷次級代謝產(chǎn)物對RNA提取的影響，Trizol裂解液存在毒性物質(zhì);改良CTAB法提取的總RNA質(zhì)量較差，無法滿足下一步試驗(yàn)的要求，操作復(fù)雜，耗時較長。因此，試劑盒法為提取新疆阿魏RNA最佳方法。以試劑盒法提取的總RNA為模板進(jìn)行PCR檢測，得到的擴(kuò)增條帶清晰，與目的片段大小一致，進(jìn)一步證明此方法提取的總RNA質(zhì)量能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

關(guān)鍵詞：新疆阿魏;RNA提取;比較

新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）系傘形科阿魏屬植物，多年生一次結(jié)實(shí)類短命草本[1-2]。 生長于內(nèi)陸干旱荒漠地區(qū)，中國僅見于新疆西部地區(qū)（現(xiàn)僅分布于伊犁市伊寧縣喀什鄉(xiāng)），主要用作鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及關(guān)節(jié)疼痛，治療腸胃氣脹等其它神經(jīng)疾患。是具有重要藥用價值的珍稀植物資源，為國家二級保護(hù)植物[3-4]。由于人們長期過度開采及農(nóng)牧民過度放牧、偷伐盜割，加之植物種子本身存在休眠且繁殖率低，種群數(shù)量連年減少，現(xiàn)已極度瀕危。

目前， 已經(jīng)建立了不同植物的多種RNA提取方法[5-7]，但關(guān)于新疆阿魏總RNA提取的研究尚未見報道。通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段深入了解新疆阿魏特殊的生長規(guī)律及藥用成分的生物合成途徑，從而達(dá)到藥用成分增產(chǎn)或植物保護(hù)的目的。對于特定的材料和不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，需要從材料內(nèi)次級代謝產(chǎn)物對總RNA提取質(zhì)量產(chǎn)生的影響、可利用的試劑、資金等方面考慮從而做出不同的選擇，對于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室條件，本試驗(yàn)所選取的試劑盒法，Trizol法和CTAB法仍然是提取新疆阿魏RNA不同方法的最佳對比選擇。建立新疆阿魏總RNA提取的最適方法，提取高質(zhì)量的新疆阿魏葉片RNA是對植物組織進(jìn)行分子水平研究的必要前提，可為后續(xù)深入研究新疆阿魏生物合成途徑及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1? ? ?材料與試劑

1.1? ?材料

4月下旬在伊寧縣喀什鎮(zhèn)拜石墩農(nóng)場北向礫石質(zhì)山坡新疆阿魏生長地采樣，剪取新疆阿魏葉片，暫時保存在冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。

1.2? ?試劑

通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）RP3301，液氮，Trizol提取液、DEPC、改良CTAB緩沖液、β-巰基乙醇、瓊脂糖等及分析純試劑。檢測引物AL/AR由華大基因（北京）公司完成。

為防止RNA降解，離心步驟均在4℃下進(jìn)行，提取RNA全程使用無RNA酶槍頭、離心管;槍頭盒、研缽、鑰匙、量筒等玻璃器皿均需用0.1%的DEPC水浸泡過夜，之后121℃滅菌30min備用，實(shí)驗(yàn)儀器需75%酒精消毒，使用實(shí)驗(yàn)室提取RNA專用的電泳槽、梳子等。

2? ? ?方法

2.1? ?總RNA提取法

2.1.1? 通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）。采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）RP3301，RNA提取方法步驟參考說明書進(jìn)行。

2.1.2? 改良CTAB法。㏑1.5mL離心管中加入1mL CTAB裂解液65℃提前預(yù)熱20min;②稱取0.2g新疆阿魏葉片在液氮中研磨至粉末狀后迅速轉(zhuǎn)移至盛有1mL CTAB裂解液（加入2%β-巰基乙醇）的離心管中，震蕩30～60s;③65℃溫浴40min，期間晃動3～4次，4℃，12000r/min，離心15min;④取上清液，轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24︰1），抽提，4℃，12000r/min，離心15min;⑤取上清液，重復(fù)步驟③;⑥取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的4mol/L LiCl，4℃沉淀過夜。⑦4℃，12000r/min離心30min后棄上清液，加400μl無水乙醇清洗2次;⑧加入40μl的RNAse-free水溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24︰1），4℃，12000r/min，離心15min;⑨取上清液，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入1/10體積3mol/L NaAc（pH=5.2）和2倍體積無水乙醇，-80℃放置30min，4℃，1200r/min，離心30min;⑩棄上清液，沉淀用400μl無水乙醇清洗2次，干燥，加入20μl的RNAse-free水溶解沉淀，并迅速放置在-20℃下保存。

2.1.3? Trizol法。操作步驟參照胡小蓉等[8]以及Trizol說明書進(jìn)行。

2.2? RNA檢測方法

2.2.1? 微量核酸蛋白儀測定RNA濃度。分別取3種方法提取的待檢測RNA 1μl，并以1μl RNase-free水為空白對照，用微量核酸蛋白測定儀測RNA濃度及OD260/OD280比值。OD260/OD280比值范圍在1.8～2.1表示提取RNA質(zhì)量良好;小于1.8時，RNA溶液中存在蛋白或者其他有機(jī)物的污染;大于2.1時，說明RNA出現(xiàn)降解。

2.2.2? 總RNA電泳檢測。分別取3種方法提取的待檢測RNA 2μl，加入6×loading buffer 1μl，混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電壓120v，電泳15～20min），在紫外成像儀下檢測完整性。條帶28S和18S清晰銳利，并且28S的亮度在18S條帶的2倍以上，由此認(rèn)為RNA的質(zhì)量良好。