miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中生長(zhǎng)激素分泌的影響

婁安鋼 季久秀 相思宇 金太花 張睿 崔長(zhǎng)艷 關(guān)立增

摘要：為研究血液外胞體中miRNA對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中生長(zhǎng)激素（GH）分泌的影響，本研究選擇在延邊黃牛和韓延牛血液外胞體中顯著差異表達(dá)的miR-6523a，利用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）和Western Blot技術(shù)，研究了miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH分泌水平的影響及miR-6523a與靶基因間的調(diào)控機(jī)制。生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-6523a靶向了SSTR5的3′非翻譯區(qū)（UTR）;qPCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加miR-6523a-mi能極顯著提高延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH mRNA和蛋白的表達(dá)（P<0.01），而添加miR-6523a-in，GH mRNA和蛋白的表達(dá)有所降低，但和對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）;與對(duì)照組相比，添加 miR-6523a-mi 能極顯著抑制SSTR5 mRNA和蛋白的表達(dá)（P<0.01），而添加miR-6523a-in，SSTR5 mRNA和蛋白的表達(dá)均有所提高，但和對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。本研究表明，miR-6523a可通過(guò)調(diào)節(jié)SSTR5基因的表達(dá)而調(diào)控垂體細(xì)胞中GH的分泌，本研究結(jié)果將為研究外胞體miRNA調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：miR-6523a;延邊黃牛;垂體細(xì)胞;GH;SSTR5

中圖分類(lèi)號(hào)： S823.8+11文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0202-06

收稿日期：2019-08-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31660614）。

作者簡(jiǎn)介：婁安鋼（1980—），男，吉林延吉人，博士，講師，主要從事動(dòng)物的遺傳與育種研究。E-mail：1163986278@qq.com。

通信作者：關(guān)立增，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物基因的表達(dá)與調(diào)控研究。E-mail：guanlizeng@163.com。延邊黃牛具有生長(zhǎng)速度慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)和出欄率低等缺點(diǎn)，導(dǎo)致飼料資源浪費(fèi)和飼養(yǎng)成本提高，這嚴(yán)重制約了延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。因此，如何提高純種延邊黃牛的生長(zhǎng)速度、縮短其養(yǎng)殖周期是加快延邊黃牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵。研究表明，外胞體（exosome）中miRNA對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。如Melnik等研究發(fā)現(xiàn)，牛乳exosome中的miRNA-21可以促進(jìn)犢牛的生長(zhǎng)[4]。陳婷用來(lái)源于豬exosome的 miR-PC-86、miR-PC-263處理C2C12細(xì)胞，結(jié)果顯示二者可調(diào)控C2C12細(xì)胞上胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）的表達(dá)，從而對(duì)豬肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮調(diào)控的作用[5]。由此可見(jiàn)，exosome中的一些miRNA可能與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育存在密切的關(guān)系，那么exosome中miRNA是否具有調(diào)控延邊黃牛生長(zhǎng)速度、提高生長(zhǎng)效率的作用有待進(jìn)一步研究。

在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)軸起著關(guān)鍵的作用[6-7]。而在生長(zhǎng)軸中腺垂體分泌的生長(zhǎng)激素（GH）是最重要的成分之一[8-9]。因此，為更全面地了解exosome中miRNA在調(diào)節(jié)延邊黃牛生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，本研究在前期工作中選擇以延邊黃牛和在長(zhǎng)發(fā)育速度、初生質(zhì)量及各年齡段體尺體質(zhì)量等均極顯著高于延邊黃牛的韓延牛作為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了延邊黃牛及韓延牛血液exosome中顯著影響GH分泌的差異表達(dá)miRNA，并篩選出顯著差異表達(dá)的miR-6523a。但關(guān)于 miR-6523a 對(duì)延邊黃牛垂體中GH的分泌的影響機(jī)制還不清楚，因此本研究旨在在體外垂體細(xì)胞水平上探究miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體GH分泌的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而為進(jìn)一步研究外胞體miRNA調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要儀器Bio-Rad 650型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）;熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）;2406-2型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）;凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Ultro-Violet Products公司）。

1.1.2主要試劑XhoⅠ、XbaⅠ，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ及青霉素、鏈霉素、LipofectamineTM 2000，均購(gòu)自GIBCO公司;GH抗體、SSTR5抗體，均購(gòu)自Abcam公司;β-actin抗體，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;總蛋白提取試劑盒，購(gòu)自北京佳蘭生物科技有限公司;miR-6523a的模擬物（mimics）（miR-6523a-mi）、抑制劑（inhibitor）（miR-6523a-in）、陰性對(duì)照（NC）、抑制劑陽(yáng)性對(duì)照（iNC），均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1miR-6523a的靶基因預(yù)測(cè)利用targetscan和RNAhybrid分析軟件對(duì)miR-6523a與GH合成分泌相關(guān)的基因（GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5等）的靶關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2延邊黃牛垂體細(xì)胞原代培養(yǎng)垂體細(xì)胞原代培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[10]。在無(wú)菌條件下分離3頭延邊黃牛的垂體組織，分別剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，用pH值為7.0的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3遍后，接種于75 mL培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊中爬壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，采用0.25%膠原酶消化，并通過(guò)差速貼壁法分離細(xì)胞，獲得垂體原代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3miR-6523a對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞中GH mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響按“1.2.2”節(jié)中所述方法對(duì)延邊黃牛的垂體組織細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)后，按2.0×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度將垂體細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度為60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前采用2 mL PBS漂洗細(xì)胞1次，并加入 0.7 mL DMEM/F12培養(yǎng)液和100 μL 1 μmol/L 生長(zhǎng)抑素（SS），之后分別將miR-6523a的mimics、inhibitor、NC對(duì)照、iNC對(duì)照分別稀釋到100 μL DMEM/F12培養(yǎng)液中。然后將10 μL轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000稀釋至100 μL DMEM/F12培養(yǎng)液中，之后將上述稀釋液分別按1 ∶1體積比混合，室溫孵育 10 min 后，將200 μL混合物加入到上述預(yù)處理的細(xì)胞孔中，使mimics、inhibitor、NC對(duì)照、iNC對(duì)照最終濃度為200 pmol/L，每組設(shè)3次重復(fù)。為了避免轉(zhuǎn)染毒性，6 h后吸棄含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，同時(shí)置換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，提取總mRNA。采用熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)GH mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，具體步驟參考文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行。

1.2.4miR-6523a對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞中GH蛋白表達(dá)的影響根據(jù)總蛋白提取試劑盒的步驟對(duì)“1.2.3”節(jié)中獲得的細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，并進(jìn)行GH蛋白Western Blot檢測(cè)具體步驟如下：按常規(guī)方法配制10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離膠和5% PAGE濃縮膠并放入垂直電泳槽中，待其凝固后，拔出木梳并向梳孔中加入1×甘氨酸緩沖液，然后加入50 μg制備的總蛋白樣品進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將上述蛋白膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，所用膜為聚偏氟乙烯（PVDF），轉(zhuǎn)膜條件為110 V、60～70 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，進(jìn)行麗春紅染色，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜效果;之后采用1×TBST溶液洗滌膜數(shù)次，去除麗春紅染色液，再用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h;之后將封閉的PVDF膜放入5 mL離心管中，加入 2 mL GH蛋白一抗，4 ℃條件下孵育過(guò)夜（12 h）。孵育結(jié)束后，采用1×TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。將洗滌后的PVDF膜放入新的 5 mL 離心管中，加入2 mL 1 ∶5 000稀釋的GH蛋白二抗，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后，用1×TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5 min。然后將PVDF膜置于發(fā)光液中顯色1 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并與β-actin內(nèi)參基因的表達(dá)進(jìn)行比較，計(jì)算GH蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5miR-6523a與SSTR5靶關(guān)系驗(yàn)證將能與miR-6523a種子序列匹配的SSTR5 3′非翻譯區(qū)（UTR）區(qū)域的上、下游30 bp之內(nèi)的序列進(jìn)行人工合成，同時(shí)將與miR-6523a種子序列匹配區(qū)域的5個(gè)堿基進(jìn)行人工突變作為對(duì)照，逐步確定miR-6523a真正結(jié)合位點(diǎn)。然后用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ酶切上述人工合成的片段及人工突變片段，將酶切產(chǎn)物分別與熒光素酶基因報(bào)告載體（pirGLO載體）連接，構(gòu)建重組pirGLO-SSTR5-3′UTR表達(dá)載體和突變載體，獲取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。之后將miR-6523a的mimic、NC與構(gòu)建好的pirGLO-SSTR5-3′UTR正?；蛉笔лd體分別稀釋為200 pmol/L，然后在轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000的作用下共轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞（CHO）細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染過(guò)程參考“1.2.3”節(jié)中的方法。48 h后收集細(xì)胞、裂解，按熒光素酶檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)熒光素酶的活性，以驗(yàn)證miR-6523a與SSTR5之間的靶關(guān)系。

1.2.6miR-6523a對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞中SSTR5的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)的影響SSTR5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的qPCR檢測(cè)和蛋白的Western Blot檢測(cè)均參考“1.2.3”和“1.2.4”節(jié)中的方法進(jìn)行。

1.2.7數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以 x±s的形式表示。*、**分別表示與NC或iNC對(duì)照組比較差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）。

2結(jié)果與分析

2.1miR-6523a與調(diào)控GH分泌相關(guān)基因靶關(guān)系預(yù)測(cè)

本試驗(yàn)使用targetscan和RNAhybrid分析軟件對(duì)miR-6523a與GH合成分泌相關(guān)的基因（GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1、SSTR5等）靶關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，miR-6523a的靶基因?yàn)镾STR5。

2.2miR-6523a對(duì)GH基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

為分析miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體GH基因表達(dá)的影響，本研究首先用miR-6523a mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的延邊黃牛垂體細(xì)胞，然后對(duì)GH基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。由圖1可知，與對(duì)照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著提高GH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能降低GH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.3miR-6523a對(duì)GH蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體GH蛋白表達(dá)的影響，本研究在GH mRNA轉(zhuǎn)錄檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)GH蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。由圖2可知，與對(duì)照組相比，添加miR-6523a-mi 能夠極顯著提高GH蛋白表達(dá)水平

（P<0.01），而添加miR-6523a-in能降低GH蛋白的表水平，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.4miR-6523a與SSTR5靶關(guān)系驗(yàn)證

為驗(yàn)證miR-6523a與SSTR5之間是否存在靶位關(guān)系，本研究將pirGLO-SSTR5-3′UTR正?；蛲蛔冚d體分別與miR-6523a/NC共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，從而通過(guò)熒光素酶活性的變化反映miR-6523a與SSTR5是否存在靶關(guān)系。由圖3可知，miR-6523a能顯著降低pirGLO-SSTR5-3′UTR正常質(zhì)粒熒光素酶的活性，而對(duì)pirGLO-SSTR5-3′UTR突變體無(wú)抑制效果。由此可知，miR-6523a能結(jié)合并作用于SSTR5的3′UTR區(qū)域，miR-6523a與SSTR5之間存在靶位關(guān)系。

2.5miR-6523a對(duì)SSTR5基因mRNA表達(dá)的影響

為驗(yàn)證miR-6523a對(duì)SSTR5基因的調(diào)控功能，本試驗(yàn)首先用miR-6523a mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的延邊黃牛垂體細(xì)胞，然后對(duì)SSTR5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qPCR檢測(cè)。由圖4可知，與對(duì)照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著降低SSTR5 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能提高SSTR5 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.6miR-6523a對(duì)SSTR5蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-6523a對(duì)延邊黃牛垂體SSTR5蛋白表達(dá)的影響，本研究在SSTR5 mRNA轉(zhuǎn)錄檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)SSTR5蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。由圖5可知，與對(duì)照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著降低SSTR5

蛋白的表達(dá)水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能提高SSTR5蛋白的表達(dá)水平，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。

3討論與結(jié)論

外胞體中的miRNA可通過(guò)血液等體液的運(yùn)輸，被運(yùn)輸?shù)絼?dòng)物機(jī)體的各個(gè)組織細(xì)胞并可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而在生長(zhǎng)調(diào)控、細(xì)胞間通訊交流、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。研究表明，exosome中的miRNA具有調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)的功能[4-5]。此外筆者所在課題組在對(duì)生長(zhǎng)性能有顯著差異的延邊黃牛和韓延牛血液exosome中的miRNA進(jìn)行差異分析時(shí)，也發(fā)現(xiàn)在2個(gè)品種牛exosome中的miRNA存在著顯著性差異，因此筆者所在課題組選擇以在延邊黃牛和韓延牛血液exosome中有顯著差異的miRNA去研究其對(duì)延邊黃牛的生長(zhǎng)性能的調(diào)控具有一定意義。

筆者所在課題組的前期研究工作證明，外胞體中的miR-6523a在延邊黃牛和韓延牛之間呈現(xiàn)顯著性差異表達(dá)，因此推理miR-6523a可能參與了生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程，可能是造成延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)性能差異的主要因素之一，而在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)軸起著關(guān)鍵的作用，而在生長(zhǎng)軸中腺垂體分泌的GH是最重要的成員之一[13]。GH可通過(guò)與生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白（GHBP）結(jié)合而運(yùn)輸，與靶器官上生長(zhǎng)激素受體（GHR）結(jié)合，促使胰島素樣生長(zhǎng)因素（IGFs）的產(chǎn)生并進(jìn)入血液循環(huán)，IGFs再通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到全身組織細(xì)胞，刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝等[14]。因此，本研究對(duì) miR-6523a與GH分泌之間的關(guān)系進(jìn)行了探索。為初步確定miR-6523a是否與GH的分泌調(diào)控有關(guān)，本研究首先通過(guò)生物學(xué)分析軟件對(duì)miR-6523a與GH分泌相關(guān)的調(diào)控基因進(jìn)行了靶關(guān)系分析。研究資料表明，與GH合成分泌相關(guān)的基因主要有GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1、SSTR5等[15]。鑒于此，筆者所在課題組利用targetscan和RNAhybrid分析軟件分別對(duì)miR-6523a與GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5的靶關(guān)系進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，miR-6523a的種子序列只與SSTR5基因存在靶關(guān)系。研究表明，SSTR5與生長(zhǎng)抑素（SS）結(jié)合后通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)進(jìn)而調(diào)控GH的合成[16]。而通過(guò)進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)道基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，miR-6523a能顯著降低pirGLO-SSTR5-3′UTR正常質(zhì)粒熒光素酶的活性，而對(duì)缺失載體的熒光素酶活性無(wú)影響，上述結(jié)果不僅說(shuō)明miR-6523a與SSTR5之間存在著靶位關(guān)系，同時(shí)可初步推測(cè) miR-6523a 是通過(guò)調(diào)控SSTR5的表達(dá)而影響GH分泌的。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-6523a是否參與了垂體細(xì)胞GH的分泌調(diào)節(jié)，本研究利用miR-6523a mimics和inhibitor對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，并利用qPCR和Western Blot技術(shù)對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。qPCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)轉(zhuǎn)染 miR-6523a mimics能極顯著增加GH mRNA和蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-6523a inhibitor能降低相應(yīng)GH mRNA和蛋白的表達(dá)，該結(jié)果說(shuō)明miR-6523a參與了調(diào)控垂體細(xì)胞中GH的分泌過(guò)程。

雖然，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-6523a與SSTR5的靶關(guān)系，但在垂體細(xì)胞水平上miR-6523a對(duì)SSTR5基因表達(dá)具體影響結(jié)果仍然未知。因此，筆者所在課題組對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行miR-6523a mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，并利用qPCR和Western Blot檢測(cè)SSTR5基因的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-6523a-mi能極顯著降低SSTR5 mRNA和蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-6523a-in能提高SSTR5 mRNA和蛋白的表達(dá)。因此，此結(jié)果進(jìn)一步證明了miR-6523a與SSTR5之間存在靶關(guān)系，并說(shuō)明 miR-6523a是通過(guò)與SSTR5作用而間接正調(diào)控GH分泌的。

總之，本研究結(jié)果證明，miR-6523a可以通過(guò)靶向SSTR5進(jìn)而調(diào)節(jié)GH的表達(dá)。本研究成果將為進(jìn)一步研究外胞體miRNA調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)，也將為延邊黃牛生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控提供新的作用靶標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]王志剛，劉和，楊胤軒. “延邊黃牛”地理標(biāo)志的歷史沿革、發(fā)展現(xiàn)狀、存在問(wèn)題及前景展望[J]. 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與管理，2014（3）：67-71.

[2]金海國(guó)，曹陽(yáng)，臧延青，等. 微衛(wèi)星DNA與延邊黃牛肉用生長(zhǎng)性狀關(guān)系[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（3）：285-288.

[3]夏廣軍，嚴(yán)昌國(guó)，金海國(guó)，等. 延邊黃牛TG基因多態(tài)性與胴體和肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（3）：500-504.

[4]Melnik B C，John S M，Schmitz G. Milk is not just food but most likely a genetic transfection system activating mTORC1 signaling for postnatal growth[J]. Nutrition Journal，2013，12（1）：103-108.

[5]陳婷. 豬乳外胞體中mRNAs、蛋白質(zhì)和miRNAs的挖掘及功能分析[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：17-37.

[6]劉建文，施用暉，樂(lè)國(guó)偉. 動(dòng)物生長(zhǎng)軸的激素調(diào)控[J]. 中國(guó)飼料，2003（14）：7-9.

[7]姜克杰，趙景鵬，黃輝. 神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸及其對(duì)畜禽的生長(zhǎng)調(diào)控[J]. 中國(guó)飼料添加劑，2006（11）：1-4.

[8]Deghenghi R，Avallone R，Torsello A，et al. Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the rat[J]. Journal of Endocrinological Investigation，2001，24（11）：RC31-RC33.

[9]Korbonits M，Grossman A B. Growth hormone-releasing peptide and its analogues：novel stimuli to growth hormone release[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism，1995，6（2）：43-49.

[10]關(guān)立增，婁安鋼，樸明淑，等. 延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH含量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：105-107.

[11]Alvarez-Erviti L，Seow Y，Yin H，et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes[J]. Nature Biotechnology，2011，29（4）：341-345.

[12]Valadi H，Ekstrm K，Bossios A，et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J]. Nature Cell Biology，2007，9（6）：654-659.

[13]王開(kāi)云，張國(guó)生，曾檢華，等. 利用生長(zhǎng)軸各激素調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)[J]. 江西畜牧獸醫(yī)雜志，2008（6）：4-6.

[14]張成龍. 南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育及其垂體組織轉(zhuǎn)錄組分析[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2016：21-45.

[15]柒啟恩. SD-大鼠垂體miRNAs的時(shí)序表達(dá)規(guī)律及功能分析[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：32-76.

[16]Horvath T L，Diano S，Sotonyi P，et al. Minireview：ghrelin and the regulation of energy balance：a hypothalamic perspective[J]. Endocrinology，2001，142（10）：4163-4169.馬曉勇，岳世林，姜國(guó)均. 豬糞中添加不同比例牛糞對(duì)蚯蚓養(yǎng)殖的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（13）：208-211.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.042