復(fù)方大黃凈化液對慢性腎衰竭大鼠的治療

韋振源 楊正騰 史偉 黃權(quán)芳 甘典輝 陳朝 龔敏陽

摘要：為研究復(fù)方大黃凈化液灌腸對慢性腎衰竭大鼠的治療作用，通過復(fù)制慢性腎衰竭模型，分為病理對照組、藥用炭組、復(fù)方大黃凈化液大、中、小劑量灌腸治療組，用藥周期為58d，測定了大鼠血清肌酐、尿素氮、尿肌酐、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量及腎臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明，復(fù)方大黃凈化液各劑量組、藥用炭組血清肌酐、尿素氮顯著降低（P<0.05），且以復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組下降更為明顯（ P<0.05）;復(fù)方大黃凈化液各劑量組24 h尿肌酐顯著升高（P<0.05），且以復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組更為明顯（P<0.05）;復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量顯著提高（P<0.05）;灌腸后各劑量組可不同程度改善腎衰竭大鼠腎臟病理改變。復(fù)方大黃凈化液對慢性腎衰竭大鼠腎功能、腎臟病理、貧血都具有一定改善作用，且存在量效依賴關(guān)系。

關(guān)鍵詞：慢性腎衰竭;復(fù)方大黃凈化液;血清肌酐;尿素氮;尿肌酐

中圖分類號：R277.5

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020 ）12-0121-03

D01：10.1408 8/j.cnki.issn0439-8114.2020.12.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

慢性腎衰竭（CRF）由許多腎臟疾病發(fā)展而來，呈慢性進行性腎實質(zhì)損害，最終將演變成尿毒癥，其病情危重、死亡率高，臨床治療非常困難。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雖然人工腎及腎移植技術(shù)有良好的療效，但費用高、技術(shù)難度大，難以普及使用[1]。

開發(fā)中醫(yī)藥療法治療本病是當前研究的熱點，具有廣闊的研究前景[2，3]。慢性腎功能衰竭的發(fā)病機制中包含虛實兩個方面，腎氣虧虛是其發(fā)病的根本，而濁毒內(nèi)盛是標實之邪，中醫(yī)藥治療慢性腎功能衰竭的關(guān)鍵是抓住早、中期。治之既要補益脾腎，治病求本，又當開通疏利，因勢利導(dǎo)，使邪有出路，總結(jié)出“補腎與瀉濁”“養(yǎng)血填精與活血化瘀”相結(jié)合的中醫(yī)藥治療一體化方案，并結(jié)合臨床實踐，研制出了以瀉濁為指導(dǎo)原則的復(fù)方大黃血液凈化液用于結(jié)腸透析。

中藥灌腸劑是指將中草藥或中成藥制成符合要求的水性、油性溶液或者混懸液，灌注于直腸以達到治療、診斷或營養(yǎng)的目的[4]。中國很多古代醫(yī)書都有關(guān)于中藥灌腸劑治療疾病的記載?！秱摗分芯陀小柏i膽汁一枚，瀉汁和少許法醋，以灌谷道內(nèi)”的記載，實為最早的中藥灌腸劑[5]。

體內(nèi)的毒素大多是通過腎臟分泌尿液而排出體外，當腎臟功能下降時，則通過腎臟排出的毒素減少。由于腸道可以排出部分毒素，所以腎衰竭的病人，通過腸道排毒就成為非常重要的途徑。中藥灌腸治療腎衰竭在中醫(yī)院普遍使用，是中醫(yī)藥治療重大疾病的一大特色，如治療腎衰竭，并具有獨特的優(yōu)勢[6，7]。結(jié)腸透析將現(xiàn)代科技與中醫(yī)特色相結(jié)合，運用于臨床以來取得了較好效果，在開展結(jié)腸透析時，運用廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院復(fù)方大黃凈化液，經(jīng)100例人次運用，無毒副作用，病人無痛苦，表明對腎衰竭期及氮質(zhì)血癥期病人尤為適用[8]。作為繼血液透析和腹膜透析后的第三種透析方法，結(jié)腸透析以其安全、無創(chuàng)、低成本、療效肯定、適應(yīng)面廣等治療特點，正被愈來愈多的臨床醫(yī)師和患者所接受，將發(fā)揮其越來越重要的臨床意義[9]。

中醫(yī)灌腸療法是中醫(yī)干預(yù)CRF的特色療法之一，系統(tǒng)評價證實中藥灌腸可以延緩CRF的進展、減少其并發(fā)癥[10，11]。但中醫(yī)灌腸療法在臨床上多作為輔助療法，很難排除其他療法的干擾，臨床證據(jù)級別較低，很難評價其確切療效及開展深入研究。因此，本研究將臨床觀察證明療效肯定的復(fù)方大黃凈化液作為研究對象，開展其干預(yù)大鼠CRF的試驗研究，以期評價其療效，并為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑 復(fù)方大黃凈化液：生大黃30 g、制附子15 g、桂枝15 g、煅牡蠣50 g、煅龍骨50 g、蒲公英45 g、土茯苓50 g，以上藥材均購自廣西一心堂藥業(yè)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室鑒定為正品，經(jīng)水煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)分別濃縮至每毫升含生藥材0.68、1.5、2.8 g，即小、中、大3種濃度，置于4℃保存?zhèn)溆?。藥用炭片（批號?00812，規(guī)格：0.3 g/片，河北長天藥業(yè)有限責(zé)任公司）。大鼠尿肌酐（UCR） Elisa試劑盒（批號：C019-2，南京建成生物工程研究所）、尿素氮（BUN）測試盒（批號：C019-3，南京建成生物工程研究所）、血肌酐（SCR）試劑盒（批號：C018-1，南京建成生物工程研究所）。

1.1.2試驗動物SPF級SD大鼠，體量（200+20）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，雌雄各1/2，單籠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗室。大鼠在試驗前于清潔級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，室溫控制在（22±2）℃，相對濕度（65±2）%，自然光照射，大鼠自由攝食飲水，飼料為標準嚙齒類動物飼料，飲水為純凈水。動物飼料、墊料均由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.3儀器 Modular-p800型全自動生化分析儀（美國Roche公司）;BX-50型顯微鏡（日本Olympus公司）;BSllOS型電子天平（德國賽多利斯集團）;En-Vision Xcite全波長多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）;LG16-W型高速低溫離心機（德國Heraeus集團）;TCL-16B型和TCL-16C型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;EL204型電子天平（梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司）;DW-86L490型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）;代謝籠。

1.2方法

1.2.1模型復(fù)制取80只健康的SD大鼠，雌雄各半。按體重隨機抽取10只作為空白對照組行假手術(shù)，其余70只參照施新猷等[12]方法進行模型復(fù)制，4周后檢測大鼠尿肌酐含量。將造模成功的60只大鼠按體重隨機分為5組，即模型組、藥用炭組、復(fù)方大黃凈化液大、中、小劑量治療組。

1.2.2 給藥于試驗第7周，開始灌腸給藥治療，空白對照組、模型對照組大鼠去離子水灌腸;藥用炭組大鼠給予0.3 mg/mL藥用炭懸浮液灌腸;復(fù)方大黃凈化液大、中、小劑量組分別用相應(yīng)灌腸液灌腸，灌腸液體量為10mL/kg，均1次/日。灌腸前先將藥液加溫至37℃，給藥周期為56 d。試驗期間各組大鼠攝食、飲水量不限。灌腸方法：先在導(dǎo)尿管的頭部做一個8 cm處的插入長度標記，然后用紅霉素軟膏涂抹記號以下部位的導(dǎo)管。取出大鼠，置大鼠頭低尾高位，左手輕輕按住動物的頭部和前肢，右手提起大鼠尾部露出大鼠的肛門，用左手將導(dǎo)尿管輕緩插入肛門8 cm，右手持5 mL的一次性注射器吸取適量的藥液，輕輕推注到導(dǎo)尿管內(nèi)灌腸。藥物灌完后取適量去離子水將導(dǎo)尿管內(nèi)的藥物全部沖人直腸內(nèi)，將導(dǎo)尿管在肛門內(nèi)保留5 min后拔出，隨后提著大鼠的尾部倒置抖動5 min，然后再放回鼠籠。

1.2.3 標本采集與檢測試驗結(jié)束前l(fā)d，代謝籠收集大鼠24 h尿液總量，用普通干燥管分別留取大鼠2 mL尿液，4℃靜置th，3 000 r/min離心10 min，-50℃保存，Elisa法集中檢測4h尿肌酐含量。水合氯醛腹腔注射麻醉，再行心包采血置于2 mL干燥管，4℃靜置th，3 000 r/min離心10 min，-50℃保存。

苦味酸法檢測血清肌酐，二乙酸一乙二酰肟法檢測尿素氮、半導(dǎo)體激光流式細胞技術(shù)檢測紅細胞計數(shù)、阻抗一比色法檢測血紅蛋白。摘取各組大鼠右側(cè)殘腎，大體外觀觀察，用10%甲醛固定液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行完全隨機設(shè)計的多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。若差異具有顯著性意義，則采用SNK-q檢驗進行多個樣本均數(shù)間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方大黃凈化液對大鼠血清肌酐、尿素氮含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組、各治療組中血肌酐、尿素氮顯著升高（P<0.05）;與模型對照組相比，復(fù)方大黃凈化液各劑量組、藥用炭組血肌酐、尿素氮顯著降低（P< 0.05）;與藥用炭組相比，復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組血肌酐、尿素氮顯著降低（P<0.05）（表1）。

2.2復(fù)方大黃凈化液對大鼠24 h尿肌酐含量的影響

復(fù)方大黃凈化液對大鼠治療結(jié)束后，與空白對照組比較，模型對照組、各治療試驗組尿肌酐極顯著降低（P<0.01）;與模型對照組相比，復(fù)方大黃凈化液各劑量組尿肌酐顯著上升（P< 0.05）;與藥用炭組相比，復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組尿肌酐顯著上升（P<0.05）;與復(fù)方大黃凈化液小劑量組相比，復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組尿肌酐也顯著上升（ P<0.05）（表2）。

2.3 復(fù)方大黃凈化液對大鼠紅細胞計數(shù)及血紅蛋白含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組、各治療組紅細胞計數(shù)及血紅蛋白顯著下降（P< 0.05）;與模型對照組相比，復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組紅細胞計數(shù)及血紅蛋白顯著上升（P<0.05）（表3）。

2.4 復(fù)方大黃凈化液對大鼠腎臟病理學(xué)的影響

空白對照組大鼠的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)大致正常，腎小球無硬化，腎小管無萎縮，腎間質(zhì)無纖維化;模型對照組大鼠局灶腎小球硬化，腎小管萎縮，腎間質(zhì)片狀纖維化，伴淋巴、單核細胞浸潤，部分小動脈亮變;復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組腎小球基本正常，腎小管空泡樣顆粒變性，部分上皮細胞崩解脫落伴再生，腎間質(zhì)無明顯纖維化，血管正常，可見單核細胞及淋巴細胞浸潤;藥用炭組和復(fù)方大黃凈化液小劑量治療組與模型組無明顯差別。

3 小結(jié)與討論

CRF屬于中醫(yī)“關(guān)格”“溺毒”等病證范疇，中醫(yī)學(xué)認為CRF早期以脾腎虧虛為主要病機，隨著疾病的進展，產(chǎn)生了濕濁、溺毒等病邪，這些病理產(chǎn)物侵犯胃腸，導(dǎo)致胃失和降、小腸失于分泌清濁、大腸失于傳導(dǎo)，臨床上出現(xiàn)脘腹飽脹、納呆、便秘、惡心、嘔吐等消化道癥狀。同時，脾胃為人體氣機升降之樞，這種胃腸功能紊亂持續(xù)存在，終將導(dǎo)致人體氣機升降失調(diào)，而變生諸證。5/6腎切除模型的建立較簡單、重復(fù)性好，是研究腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展機制，延緩腎功能惡化的理想模型[13-15]。

血清肌酐、尿素氮、24 h尿肌酐定量、紅細胞計數(shù)及血紅蛋白及腎臟病理學(xué)改變等指標是反映CRF病情的重要指標。試驗結(jié)果表明，模型對照組血肌酐、尿素氮顯著升高，24 h尿肌酐定量顯著升高，紅細胞計數(shù)及血紅蛋白顯著下降，病理方面局灶腎小球硬化，腎小管萎縮，腎間質(zhì)片狀纖維化，伴淋巴、單核細胞浸潤，部分小動脈亮變，說明模型復(fù)制成功。藥用炭在降低血肌酐、尿素氮方面具有一定作用，其他方面無明顯作用。復(fù)方大黃凈化液各劑量組對上述異常指標都有不同程度改善，提示復(fù)方大黃凈化液對于大鼠CRF確實具有綜合的保護作用，其中以復(fù)方大黃凈化液大、中劑量組改善明顯，提示復(fù)方大黃凈化液干預(yù)大鼠CRF具有一定量效依賴關(guān)系。本試驗證明復(fù)方大黃凈化液對CRF大鼠具有保護作用，為臨床應(yīng)用該療法提供了依據(jù)，同時為進一步開展中醫(yī)灌腸療法的內(nèi)在機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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基金項目：廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院級科研項目（ 2017ZJ002）;廣西科技廳重點研發(fā)項目（AB19110003）;廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心開放課題（KJT1900105）;2019年廣西中醫(yī)藥大學(xué)青年基金項目（2019QN036）;2019年度廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2019KY0341）;國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中（壯）藥化學(xué)與質(zhì)量分析實驗室項目（國中醫(yī)藥發(fā)2009[21]號）

作者簡介：韋振源（1984-），男，廣西象州人，主管藥師，碩士，主要從事中藥學(xué)的相關(guān)研究，（電話）18776728630（電子信箱）3444848285@qq.com;通信作者，龔敏陽（1970-），男，副主任藥師，主要從事中藥學(xué)的相關(guān)研究，（電子信箱）674632459@qq.com。