miRNA-214靶向作用于鈣網(wǎng)蛋白保護(hù)阿霉素相關(guān)大鼠心肌損傷

馬蕓蕓 李 禮 趙 琳

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科，銀川 750001）

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用[1-2]。在毒性作用試驗(yàn)中，阿霉素具有顯著的心肌毒性，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的心肌損傷，最終發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病或充血性心力衰竭[3-4]。miRNA-214是近年來發(fā)現(xiàn)的一類對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用的微小RNA，在心肌細(xì)胞的相關(guān)研究中，miRNA-214的表達(dá)同樣豐富[5-6]。但目前關(guān)于miRNA-214對阿霉素心肌損傷的相關(guān)研究較少。因此，本研究探討miRNA-214對阿霉素相關(guān)心肌損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床提供新的靶向治療方向。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

6～8周SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量（240±20） g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，動物合格證號：0001517。鈣網(wǎng)蛋白抗體購于上海順博生物工程有限公司；熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 攜帶miRNA-214的腺相關(guān)病毒構(gòu)建

構(gòu)建中間載體質(zhì)粒pGenesil-12-pre-miRNA-214，限制性酶切位點(diǎn)后的片段中包含miRNA-214和miR-miRNA-214，構(gòu)建腺相關(guān)病毒質(zhì)粒 pAAV-premiRNA-214，將質(zhì)粒導(dǎo)入AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生含目的基因miRNA-214的腺相關(guān)病毒。

1.3 模型構(gòu)建及分組

將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、miRNA-214轉(zhuǎn)染組，分別采用不同的處理方法。對照組：正常飼養(yǎng)，不采取任何處理。模型組：采用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉，將10 mg阿霉素溶解于30 mL生理鹽水中，根據(jù)1.8 mg/kg劑量標(biāo)準(zhǔn)，隔日尾靜脈注射阿霉素，總計(jì)給藥10次，建立阿霉素心肌損傷模型。 miRNA-214轉(zhuǎn)染組：麻醉后氣管插管，連接小型動物呼吸機(jī)，造模過程同模型組。向大鼠尾靜脈注射0.1 mL miRNA-214-AAV。

1.4 超聲心動圖檢測

大鼠麻醉后，固定，備皮，采用彩色多普勒超聲儀對大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，指標(biāo)包括左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventriular end-systolic diameter，LVSD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventriular end-diastolic diameter， LVDD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒張末期室間隔厚度（interventricular septal thickness， IVST）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 心質(zhì)量及心肌肥厚指數(shù)測定

各組大鼠稱質(zhì)量，麻醉后，取出心置于生理鹽水中，沖洗干凈，用雙側(cè)濾紙吸干水分，用電子天平稱量全心質(zhì)量、左心室和右心室質(zhì)量。全心肥厚指數(shù)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量；左心室心肌肥厚指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量；右心室心肌肥厚指數(shù)=右心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 炎癥因子及心功能標(biāo)志物檢測

收集各組大鼠靜脈血，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠炎癥因子谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平及心功能標(biāo)志物肌酸激酶（creatine kinase, CK）、B型利鈉肽（B type natriuretic peptide, BNP）水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 心組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

切取各組大鼠左心室前壁危險區(qū)心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋后切片，進(jìn)行H-E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)改變并采集圖像。

1.8 PCR檢測心肌組織miRNA-214表達(dá)水平

參照操作說明書提取總RNA，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后擴(kuò)增成DNA。miRNA-214正向引物序列為5'-ACAGCAGGCAC AGAC-3'；反向引物序列為5'-GAGCAGGCTGGAG AA-3'；miRNA-214探 針 引 物 序 列 為5'-FAM+AGG CAGTGCGCGTG-MGB-3'；選取U6作為內(nèi)參基因。定量實(shí)時PCR檢測為一式3份進(jìn)行，包括無模板對照，將miRNA-214的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為U6。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃變性30 s，50℃退火30 s，40個循環(huán)，最后70℃延伸10 min結(jié)束。實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)的平均水平使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行微小修正。閾值循環(huán)（Ct）定義為熒光通過固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。計(jì)算miRNA-214和U6的平 均Ct，將ΔCt確 定 為miRNA-214的 一 式3份Ct的 平 均 值 減 去U6的 一 式3份Ct的 平 均 值，與U6相比，樣品的miRNA-214的相對拷貝數(shù)表示為2-ΔΔCt。

1.9 免疫印跡檢測心肌組織鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)水平

收集各組的大鼠心肌組織，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度?；旌仙蠘泳彌_液，煮沸變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉鈣網(wǎng)蛋白一抗（工作濃度1∶500）二抗（工作濃度1∶2 500）孵育、ECL法顯影定影。通過Quantity One軟件分析條帶強(qiáng)度，以U6為內(nèi)參，檢測鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量

對照組大鼠一般狀況良好，進(jìn)食飲水正常，無死亡情況發(fā)生。模型組大鼠在第4天時，出現(xiàn)明顯的精神不佳，進(jìn)食及活動減少，毛發(fā)無光澤；miRNA-214轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)不良癥狀的時間較模型組晚，進(jìn)食量及飲水量略高于模型組。對照組大鼠體質(zhì)量一直呈顯著的上升趨勢，模型組與miRNA-214轉(zhuǎn)染組大鼠體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢，但miRNA-214轉(zhuǎn)染組大鼠體質(zhì)量下降更為緩慢（圖1）。

2.2 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較

第21天處死大鼠，完整取出心及肝。3組大鼠的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量、全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，模型組及miRNA-214轉(zhuǎn)染組全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量顯著降低，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，miRNA-214轉(zhuǎn)染組全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量顯著升高，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

表1 各組大鼠心質(zhì)量及肥厚指數(shù)比較（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.3 各組大鼠心組織病理改變比較

對照組心肌組織結(jié)構(gòu)未明顯異常，肌纖維完整，橫紋排列整齊，肌漿內(nèi)無空泡變性。與對照組比較，模型組心肌纖維排列紊亂，邊界不規(guī)則，心肌纖維斷裂，細(xì)胞水腫，胞質(zhì)染色變淺，局部有炎細(xì)胞浸潤。 miRNA-214 轉(zhuǎn)染組心肌纖維破壞程度較模型組顯著減輕，肌纖維完整，橫紋排列整齊，有少許中性粒細(xì)胞浸潤，無空泡變性（圖2）。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞miRNA-214表達(dá)水平比較

與對照組大鼠相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞中miRNA-214的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，轉(zhuǎn)染組大鼠心肌細(xì)胞中miRNA-214相對表達(dá)量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 各組大鼠炎癥因子及心功能指標(biāo)比較

3組大鼠的心功能相關(guān)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。兩兩比較后顯示，模型組的ALT、AST、LDH、CK、BNP水平最高，miRNA-214轉(zhuǎn)染組次之，對照組相關(guān)指標(biāo)均最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 3組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表2 3組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.6 各組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

3組 大 鼠 的LVSD、LVDD、LVFS、LVPWT、LVEF比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與對照組比較，模型組及miRNA-214轉(zhuǎn)染組LVSD、LVDD顯著升高，LVFS、LVEF顯著降低；與模型組比較，miRNA-214轉(zhuǎn)染組LVSD、LVDD顯著降低，LVFS、LVEF顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 3組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表3 3組大鼠心結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

圖1 3組大鼠體質(zhì)量變化.圖2 3組大鼠心肌組織病理改變，標(biāo)尺=100 μm。A：對照組；B：模型組；C：miRNA-214轉(zhuǎn)染組.圖3 3組大鼠心肌細(xì)胞miRNA-214表達(dá)情況。*P＜ 0.05 vs 對照組；△P＜0.05 vs 模型組.Fig 1 Changes in body mass of three groups of rats.Fig 2 H-E staining diagram of myocardial cells in three groups of rats， bar=100 μm. A：Control group；B：Model group；C：miRNA-214 transfection group.Fig 3 Expression of miRNA-214 in myocardial cells of three groups of rats. *P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model.

2.7 各組大鼠心肌細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)比較

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組鈣網(wǎng)蛋白相對表達(dá)量升高；與模型組相比，轉(zhuǎn)染組鈣網(wǎng)蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 3組大鼠心肌細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)水平Fig 4 Expression level of calreticulin in cardiomyocytes of three groups of rats

3 討論

腫瘤化療藥物阿霉素具有明顯的心肌毒性并可引起心力衰竭，在不削弱其化療作用的前提下減輕其心肌毒性是臨床熱點(diǎn)的研究方向[7]。Gupta等[8]報道在阿霉素誘導(dǎo)的心臟模型中，RNA結(jié)合蛋白QKI表達(dá)下降，確認(rèn)OKI提高了心肌細(xì)胞對阿霉素的敏感性，而過表達(dá)QKI則抑制了阿霉素誘導(dǎo)的心肌凋亡，并證實(shí)是通過調(diào)控circRNA的表達(dá)發(fā)揮作用。

本研究對大鼠一般狀況及體質(zhì)量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示對照組大鼠一般狀況良好，進(jìn)食飲水正常，無死亡情況發(fā)生。相較于模型組，miRNA-214轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出可有效緩解其不良狀態(tài)，并且出現(xiàn)不良癥狀的時間較模型組晚，進(jìn)食量及飲水量略高于模型組。實(shí)時PCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-214轉(zhuǎn)染組miRNA-214的表達(dá)水平比對照組僅模型組大鼠明顯升高。本研究成功使得miRNA-214在小鼠心中過表達(dá)，過表達(dá)能夠誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚，并導(dǎo)致心功能受損，這與已有研究結(jié)果一致[9-10]。另外，miRNA-214的過度表達(dá)可逆轉(zhuǎn)缺陷心室肌細(xì)胞的增殖低下，大鼠miRNA-214的靶向缺失會出現(xiàn)異常的心形態(tài)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)心肌損傷狀況后，心肌細(xì)胞增殖受阻，可能會影響其他miRNA的表達(dá)， 從而出現(xiàn)某類型miRNA表達(dá)量下降；從另一個角度來說，如果刺激相應(yīng)類型miRNA的過表達(dá)，可能會在一定程度上抑制心肌細(xì)胞的增殖[11]。另一方面，本研究通過腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建心肌細(xì)胞高表達(dá)miRNA-214的大鼠模型。通過超聲心動圖檢查顯示，模型組大鼠的LVSD、LVDD顯著高于對照組及轉(zhuǎn)染組，LVFS、LVEF明顯較低，提示大鼠以左心室結(jié)構(gòu)擴(kuò)張、收縮功能下降為主，表明模型構(gòu)建初步成功。同時，對大鼠心進(jìn)行稱重后顯示，模型組的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量最低，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)最高，miRNA-214轉(zhuǎn)染組次之。出現(xiàn)上述結(jié)果可能歸因于miRNA-214以組織特異性方式表達(dá)，并在組織發(fā)育和許多生物過程中起關(guān)鍵作用。miRNA負(fù)責(zé)細(xì)胞表觀基因組的改變，能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。最近研究表明，miRNA和其他表觀遺傳因子可以相互調(diào)節(jié)或協(xié)同調(diào)節(jié)幾種生物過程[12]。許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明鈣網(wǎng)蛋白可以調(diào)節(jié)多種類型細(xì)胞或疾病狀態(tài)中的miRNA表達(dá)[13]，另一方面，miRNA可以直接靶向表觀遺傳因子，例如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或鈣網(wǎng)蛋白，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并有效調(diào)控miRNA與其他表觀遺傳機(jī)制之間的協(xié)調(diào)行動，以加強(qiáng)miRNA-214基因表達(dá)[14]。

鈣網(wǎng)蛋白是一種進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白質(zhì)，蛋白在腫瘤細(xì)胞，凋亡的細(xì)胞，一些藥物處理的細(xì)胞（如蒽環(huán)類藥物）的表面表達(dá)量要多于正常的細(xì)胞[15]。研究者通過在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可增加大鼠心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，且其表達(dá)量與梗死面積呈負(fù)相關(guān)[16]。王建禮[17]發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白后處理減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞死亡、LDH漏出和氧化應(yīng)激程度。本研究免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)量升高；與模型組相比較，轉(zhuǎn)染組中鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)量顯著減低，表明miRNA-214的過表達(dá)下調(diào)了鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，這可能是miRNA-214發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一，后續(xù)工作將探討其生物學(xué)功能及其在心肌損傷保護(hù)中的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miRNA-214可通過下調(diào)鈣網(wǎng)蛋白，緩解心肌損傷，有望成為一個新的治療靶標(biāo)。