營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌高產(chǎn)L-蘇氨酸的研究

周泉錢，朱長(zhǎng)俊，杜雨桐，羅奮杰，錢廣

（嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001）

蘇氨酸（Threonine）是一種重要的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，有恢復(fù)人體疲勞、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的效果。在醫(yī)藥上，由于蘇氨酸的結(jié)構(gòu)中含有羥基，對(duì)人體皮膚具有保濕作用，在體內(nèi)還能促進(jìn)磷脂合成和脂肪酸氧化。目前，生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要方法是大腸桿菌發(fā)酵法。草酰乙酸是L-蘇氨酸的前體，而大腸桿菌的草酰乙酸主要來(lái)源于三羧酸循環(huán)[1]，在此循環(huán)中天冬氨酰半醛（Aspartyl semialdehyde）和L-高絲氨酸（L-Homoserine）會(huì)分別生成副產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸（L-Lysine）和L-甲硫氨酸（L-Methionine）。通過(guò)化學(xué)誘變后篩選出賴氨酸缺陷型大腸桿菌（Lys菌株）和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型[2]大腸桿菌（Met-Lys菌株），該菌株的L-賴氨酸和L-甲硫氨酸支路途徑被阻斷，干路途徑的碳流量增加，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)量增加。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia coli），本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：按文獻(xiàn)[3-4]配制5%（V/V）的硫酸二乙酯乙醇溶液（DES）；pH=6.9磷酸緩沖鹽溶液（PBS）0.100 mol/L；25%（V/V）硫代硫酸鈉溶液；L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.630×10-4mol/L；四氯對(duì)苯醌乙醇溶液3.000×10-3mol/L；硼砂溶液0.100 mol/L。

器材：UV-1100紫外分光光度計(jì)，濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司；SBA1243電子分析天平，哈爾濱德遠(yuǎn)科技開(kāi)發(fā)有限公司；Eppendorf 5810R離心機(jī)，深圳市德優(yōu)平科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)基種類

保存菌種進(jìn)行劃線分離，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)基種類：種子培養(yǎng)基；基本培養(yǎng)基；二倍氮源高滲培養(yǎng)基；賴氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基；甲硫氨酸、賴氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基；大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基[5]。實(shí)驗(yàn)流程圖如圖1所示?；九囵B(yǎng)基、賴氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基及甲硫氨酸與賴氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基分別用MM、[Lys]、[Met、Lys]表示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.2.2 測(cè)定生長(zhǎng)曲線及致死曲線

取15個(gè)150 mL錐形瓶，按計(jì)劃的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短分別編號(hào)為 0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、K（K為空白對(duì)照組，其余編號(hào)數(shù)字代表培養(yǎng)小時(shí)數(shù)）。每個(gè)錐形瓶中加入20 mL肉湯培養(yǎng)基，并按1%接種量接種0.2 mL種子液；K組和“0”組接種完成后立即于600 nm處測(cè)定吸光度并記錄數(shù)據(jù)，其余組37 ℃、180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，相應(yīng)時(shí)間到達(dá)后取出測(cè)定吸光度，處理數(shù)據(jù)并繪制生長(zhǎng)曲線圖[6]。

取11組1.5 mL的EP管，分別添加不同量的5%DES（0～100 μL，以10 μL的量遞增），并用PBS定容至1.5 mL，誘變時(shí)長(zhǎng)為15 min（從加入5% DES起到加入25%硫代硫酸鈉溶液終止），取1.0 mL處理液加入1.0 mL 25%（V/V）硫代硫酸鈉溶液終止誘變，然后各組取0.1 mL涂布于肉湯固體培養(yǎng)基上，3個(gè)平行，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，菌落計(jì)數(shù)，繪制致死曲線，計(jì)算公式如式1所示。

1.2.3 菌種誘變

Lys菌株的誘變：采用30 μL/mL菌懸液的比例進(jìn)行誘變，誘變時(shí)長(zhǎng)為15 min，誘變結(jié)束按照5%的接種量，移取2.5 mL處理液接種至50 mL[Lys]液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，然后制成同體積的菌懸液。Met-Lys菌株的誘變過(guò)程同上，擴(kuò)增培養(yǎng)的培養(yǎng)基改為50 mL[Met、Lys]液體培養(yǎng)基[7]。

1.2.4 篩選目標(biāo)菌株

取0.1 mL經(jīng)淘汰、純化后的菌懸液涂布于[Lys]平板，涂布6個(gè)平板；37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。從[Lys]平板上挑取72個(gè)菌落，對(duì)應(yīng)點(diǎn)植至MM平板和[Lys]平板上；經(jīng)培養(yǎng)后挑取在[Lys]平板上生長(zhǎng)情況比MM平板好的菌株作為疑似菌株。將其編號(hào)，進(jìn)行復(fù)檢，分別在[Lys]平板和MM平板上進(jìn)行劃線，連續(xù)培養(yǎng)5代，比較第5代的菌株在[Lys]平板與MM平板上的生長(zhǎng)情況，若[Lys]平板上的菌株生長(zhǎng)情況比MM平板的好，則說(shuō)明該菌株是可以穩(wěn)定遺傳的Lys菌株。

Met-Lys菌株的篩選：除涂布平板進(jìn)行相應(yīng)的變化，大致過(guò)程同上，獲得穩(wěn)定遺傳的Met-Lys菌株。

1.2.5 發(fā)酵及L-蘇氨酸產(chǎn)量的測(cè)定

按照5%的接種量分別將普通大腸桿菌、賴氨酸缺陷型和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌的菌懸液接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3瓶，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h[8-9]。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，取上清液稀釋500倍，準(zhǔn)確移取1.0 mL稀釋液置于10 mL容量瓶中，加0.5 mL硼砂溶液（0.100 mol/L）和1.5 mL四氯苯醌溶液（0.003 mol/L），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，置50 ℃水浴40 min，水流冷卻至室溫，以相同方法制備試劑空白為參比，石英比色皿在352 nm處測(cè)吸光度A，求出L-蘇氨酸的含量[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線和5% DES致死曲線的測(cè)定

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)室保存大腸桿菌在2 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，2～6 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。5% DES對(duì)大腸桿菌具有很強(qiáng)的致死作用，如圖3所示，添加量為30 μL時(shí)，致死率達(dá)到71.03%；添加量為50 μL時(shí)，致死率接近100%。在菌種的DES誘變過(guò)程中，要求致死率為70%～80%是最佳的誘變條件，因此，選取30 μL作為5% DES的添加量，進(jìn)行大腸桿菌的菌種誘變。

圖2 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線圖

2.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

根據(jù)不同平板上菌落的生長(zhǎng)情況可以初步篩選出疑似Lys菌株和Met-Lys菌株，然后進(jìn)行下一步檢測(cè)，初篩結(jié)果如圖4所示。圈出的菌落在第2排的平板上的生長(zhǎng)情況均比第1排的平板要好，因此可知圈出的菌落為疑似營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。

圖3 大腸桿菌5% DES致死曲線圖

圖4 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的初篩結(jié)果

2.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的復(fù)檢

如圖5所示，通過(guò)比較不同平板上疑似菌株的生長(zhǎng)情況，可以發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充型培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況比MM培養(yǎng)基上要好的多，由此便可以確認(rèn)篩選出了營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。

圖5 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的復(fù)檢結(jié)果

表1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株與普通大腸桿菌菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量

2.4 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株穩(wěn)定性檢測(cè)

連續(xù)培養(yǎng)5代后，可以發(fā)現(xiàn)Lys菌株和Met-Lys菌株都能較好地穩(wěn)定遺傳。

2.5 L-蘇氨酸產(chǎn)量測(cè)定

如表1所示，Lys菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量比普通大腸桿菌增加了26.01%，達(dá)到了4.07 g/L；Met-Lys菌株比普通菌株增加了299.38%，達(dá)到了12.90 g/L。結(jié)合胡丹等人[13]的研究發(fā)現(xiàn)，此次誘變出來(lái)的Met-Lys菌株比其使用的工程菌L-蘇氨酸的產(chǎn)量（1.80 g/L）提高了6.17倍。

3 結(jié)論

賴氨酸缺陷型大腸桿菌和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌均可以有效提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量，賴氨酸缺陷型大腸桿菌的L-蘇氨酸產(chǎn)量比普通大腸桿菌增加了26.01%；賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌比普通大腸桿菌增加了299.38%。雖然選育出的單一營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變株可以有效提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量，但是與雙重突變株相比仍然存在一定的差距。本實(shí)驗(yàn)僅是通過(guò)化學(xué)誘變選育了雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，從而提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。接下來(lái)的研究可通過(guò)改變發(fā)酵條件或是加快L-蘇氨酸的胞外分泌速度減弱L-蘇氨酸反饋抑制，來(lái)進(jìn)一步提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。