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    快速檢測(cè)Y染色體微缺失方法的建立

    2020-08-27 06:41:00楊神州
    生物化工 2020年4期
    關(guān)鍵詞:電泳核酸染色體

    楊神州

    (復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

    據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球約1/10的育齡期夫婦不能正常生育后代,主要原因之一是男性因素引起的不育[1]。Y染色體微缺失是男性不育的原因之一[2]。

    目前Y染色體AZF微缺失檢測(cè)的方法很多。歐洲男科學(xué)會(huì)(EAA,European Academy of Andrology)和歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟(EMQN,European Molecular Genetics Quality Network)發(fā)布了Y染色體微缺失的分子診斷指南,指出對(duì)特異性標(biāo)簽位點(diǎn)(STS,Sequence tagged sites)進(jìn)行擴(kuò)增具有簡單、快速、靈敏、特異的特點(diǎn),是檢測(cè)AZF缺失的理想方法[3]。目前,多重定性PCR法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR都是基于檢測(cè)STS來確定是否有已知的缺失,該方法操作簡單,檢測(cè)周期相對(duì)較短[4-5],但需要DNA提取等過程。

    近年來,出現(xiàn)了很多核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),如核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)等,反應(yīng)時(shí)間短、特異性好、不需復(fù)雜儀器設(shè)備等特點(diǎn)是傳統(tǒng)PCR難以超越的[6-7]。相對(duì)其他核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來說,重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)技術(shù)具有不需熱變性、引物設(shè)計(jì)相對(duì)較簡單、在25~42 ℃恒溫條件下可快速完成核酸擴(kuò)增等諸多優(yōu)點(diǎn)[8]。RPA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、病原微生物、食品安全等多個(gè)領(lǐng)域[9]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    收集4名志愿者的血液樣本,其中男女各2名。這4名志愿者中,2名男性均無7個(gè)STS(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY14)缺失,女性均無以上STS。

    1.2 試劑和儀器

    天根基因組DNA提取試劑盒;Chelex-100,北京索萊寶;通用一步法DNA提取液,上海生工;2×GoldStar Best MasterMix PCR擴(kuò)增試劑,康為世紀(jì);RPA試劑,TwistDx公司。

    ABI2720 PCR儀,Applied Biosystems;NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì),Thermo Fisher,用于測(cè)定A260/230和A260/A280以及核酸濃度。

    1.3 實(shí)驗(yàn)引物

    引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,PCR引物序列參考EAA和EMQN發(fā)布的Y染色體微缺失分子診斷指南。RPA引物根據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì),具體設(shè)計(jì)原則為:5′端3~5個(gè)核苷酸避免聚鳥嘌呤(G),最好為胞嘧啶(C);3′端3個(gè)核苷酸是G或C,有助于聚合酶的穩(wěn)定性;不要出現(xiàn)聚嘌呤和嘧啶;GC含量在30%~70%;避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等;靶標(biāo)區(qū)域避開重復(fù)元件,引物序列見表1

    1.4 裂解條件

    裂解條件1:5 μL血液樣本中加入45 μL 5 mmol/L的NaOH溶液,90 ℃孵育2 min。

    裂解條件2:5 μL血液樣本中加入45 μL溶液A(NaOH濃度為5 mmol/L,Chelex-100濃度為5%),90 ℃孵育 2 min。

    裂解條件3:5 μL血液樣本中加入45 μL通用一步法DNA提取液,80 ℃加熱2 min。

    1.5 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

    PCR反應(yīng)體系條件參考EAA和EMQN發(fā)布的Y染色體微缺失分子診斷指南。

    RPA反應(yīng)體系為25 μL,包括2×Reaction Buffer 12.5 μL,10 mmol/L dNTPs 4.6 μL,10×Basic E-mix 2.5 μL,10 μmol/L引物A和10 μmol/L引物B各1.2 μL,20×Core Reaction 1.25 μL,混勻后加入1.25 μL的280 mmol/L MgOAc和1 μL DNA模板。39 ℃反應(yīng)30 min。

    1.6 產(chǎn)物的檢測(cè)

    取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺(TAE)電泳緩沖液瓊脂糖中電泳,200 V電泳25 min。

    RPA產(chǎn)物中加入25 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺緩沖液(TE buffer),混勻后98 ℃孵育1 min。取5 μL產(chǎn)物用1.5% TAE瓊脂糖電泳,200 V電泳25 min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 裂解條件的選擇

    裂解和提取的DNA經(jīng)Qubit和紫外分光光度計(jì)檢測(cè),濃度和檢測(cè)結(jié)果如表2所示。裂解條件1和裂解條件2提取濃度差別不大,濃度最高;天根試劑盒提取濃度次之,裂解條件3提取濃度最低。A260/230和A260/A280顯示天根試劑盒提取的DNA純度最高,裂解條件1~3得到的DNA純度較低。

    表1 STS引物列表

    表2 不同提取方法的濃度和吸光度

    圖1顯示不同提取方法提取血液DNA經(jīng)過選用sY255引物組進(jìn)行RPA擴(kuò)增之后電泳的條帶。結(jié)果顯示,裂解條件1、裂解條件2、天根試劑盒提取后擴(kuò)增產(chǎn)物清晰可見,極易辨別,裂解條件3的擴(kuò)增產(chǎn)物有微量條帶出現(xiàn),血液直接為模板的擴(kuò)增無產(chǎn)物出現(xiàn)??紤]到裂解條件2中的Chelex-100極易沉降,在實(shí)際檢測(cè)中不方便,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇條件1進(jìn)行檢測(cè)。

    圖1 不同提取方法的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    2.2 引物特異性檢測(cè)

    男性和女性血液樣本按照裂解條件1裂解后,分別取1 μL作為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增,正常男性樣本每個(gè)STS都擴(kuò)增出了清晰的目的條帶,而正常女性樣本均未見目的條帶,凝膠圖像見圖2。

    圖2 引物特異性檢測(cè)電泳圖

    3 結(jié)論

    使用快速堿裂解法提取DNA,并沒有經(jīng)過酶解、洗滌等過程,證明了血液通過該方法可以快速地用于RPA,解決了血液樣本對(duì)RPA抑制這一問題。該研究進(jìn)一步將Y染色體微缺失檢測(cè)和RPA結(jié)合,證明在操作簡單、儀器需求程度低的情況下,核酸裂解僅需2 min,擴(kuò)增不超過30 min,產(chǎn)物變性和電泳不超過27 min,1 h內(nèi)即可檢測(cè)出結(jié)果,實(shí)現(xiàn)了Y染色體微缺失的快速檢測(cè)。

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