新型鉑類抗癌藥舒尼鉑原料藥中催化劑鈀殘留量的測定

張曉南，普冰清，陳雪江，李東嫻，牛延菲，徐紅貴

(1 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2 云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；3 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的重大疾病，是繼心血管疾病后的全球第二大死亡原因，每年導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過800萬人。惡性腫瘤特點(diǎn)之一是腫瘤細(xì)胞不受控制的快速增殖，增殖需要DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此，DNA是抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)。鉑類藥物就是一類以DNA為作用靶點(diǎn)的無機(jī)抗癌配合物[1]。它們以被動擴(kuò)散的方式和借助載銅蛋白(CTR1)的運(yùn)轉(zhuǎn)方式跨過細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)的水介質(zhì)下進(jìn)行水合反應(yīng)、生成高化學(xué)活性的水合配陽離子cis-[A2Pt(II)(H2O)2]2+，擴(kuò)散遷移到細(xì)胞核后，與DNA鳥嘌呤上第7位氮原子以配位鍵的形式結(jié)合，形成與DNA的鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交聯(lián)cis-A2Pt(II)2+/DNA，從而破壞了癌細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡[2]。

含鉑類藥物的聯(lián)合化療一直是治療胃癌的首選方案，近年來，分子靶向療法在癌癥的治療中取得了極大的成功，但是靶向療法的療效因人而異，特別是胃癌，對靶向療法不敏感，被喻為分子靶向治療的“盲區(qū)”。同時，靶向治療通常與化療聯(lián)用有協(xié)同抗癌效應(yīng)，因此，以鉑類藥物為主或參與聯(lián)合化療的方案仍是臨床治療晚期胃癌和預(yù)防胃癌手術(shù)后復(fù)發(fā)的重要方法。但鉑類抗癌藥普遍存在肝腎毒性高，骨髓抑制毒性大，很多老年患者不能耐受，以及交叉耐用性等問題。因此，研制毒性小、對胃癌有較高療效的新型鉑類抗癌藥物仍具有重要社會意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-5]。

舒尼鉑的研發(fā)正是以改善鉑類抗癌藥的肝腎毒性和骨髓抑制毒性為目的，從而達(dá)到提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期的最終目標(biāo)。舒尼鉑目前已完成了臨床前的研發(fā)，進(jìn)入臨床試驗(yàn)申報(bào)階段，在其合成過程中使用了含金屬鈀的催化劑，因此對鈀催化劑殘留量的控制是其質(zhì)量控制中重要的一環(huán)。基于此，本文建立了舒尼鉑原料藥中的鈀元素含量測定的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究[6]，以期為舒尼鉑和同類的鉑類抗癌藥的新藥研發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

AG285型電子天平，瑞典METTLER TOLEDO公司；Speedwave 4微波消解系統(tǒng)，德國Berghof公司；7700X電感耦合等離子質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；Advantage 10 Milli-Q超純水發(fā)生器，美國密理博公司。

鈀(Pd)標(biāo)準(zhǔn)液(批號：198016，濃度為1000 μg·mL-1)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；內(nèi)標(biāo)溶液(ICP-MS Internal Std Mix，批號：5188-6525)，Agilent Technologies；硝酸(優(yōu)級純)；去離子水(超純水)；供試品：舒尼鉑原料藥，由本實(shí)驗(yàn)室合成，批號：SNB-01。

2 方法與結(jié)果

2.1 工作條件

射頻功率：1600 W；等離子體氣體流量：15 L·min-1；輔助氣流量：1.0 L·min-1；載氣流量1.05 L·min-1；霧化器溫度：2 ℃；采集模式：質(zhì)譜圖；峰型：3個點(diǎn)；積分時間：0.3～0.9 s。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用5%稀釋制成每1 mL各含銦元素1 μg的混合溶液，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品液(1000 μg·mL-1)適量，用5%硝酸溶液稀釋制配制成含鈀1500 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。精密吸取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用5%硝酸稀釋至刻度，制成含鈀質(zhì)量濃度為25、60、90、120、150 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液即得。以上溶液應(yīng)臨用新配。

2.4 供試品溶液的制備

稱取樣品約0.1 g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加硝酸8 mL，混勻，蓋好內(nèi)蓋，旋緊外蓋，浸泡過夜，置微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解，消解程序見表1。待消解完全后，藥液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量超純水洗滌消解罐3次，合并洗液，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。消解所得溶液應(yīng)無色透明，無肉眼可見異物。同法制備樣品空白溶液。

表1 微波消解程序

2.5 測定方法

測定時選取的同位素為105Pd，以115In作為內(nèi)標(biāo)。儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析工作過程中始終插入內(nèi)標(biāo)溶液中，依次將儀器的樣品管插入各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中進(jìn)行測定(濃度依次遞增)，以待測元素計(jì)數(shù)值與內(nèi)標(biāo)元素計(jì)數(shù)值的比率值(3次讀數(shù)的平均值)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將儀器的樣品管插入供試品溶液中測定，取3次讀數(shù)的平均值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得相應(yīng)的樣品溶液中待測元素濃度。在同樣的分析條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)，扣除空白干擾。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)溶液測定，以鈀元素濃度為橫坐標(biāo)，鈀元素計(jì)數(shù)值和對應(yīng)銦元素計(jì)數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。結(jié)果表明鈀元素在0～150 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.008x+0.007，r=0.999。

2.6.2 檢測限與定量限測定

制備樣品空白溶液平行11份，依次按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計(jì)算11次空白溶液中鈀元素濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ。3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為定量限，結(jié)果鈀元素檢出限為0.0050 μg·L-1，定量限為0.0167 μg·L-1；按取樣品0.1 g，定容至50 mL計(jì)，檢出限為0.0025 μg·g-1，定量限為0.0084 μg·g-1，可以滿足檢測要求。

2.6.3 回收率試驗(yàn)

稱取供試品6份，每份約0.1 g，精密稱定(批號：SNB-01已測得含Pd 2.21 μg·g-1)，加入約和樣品原含量相等量的鈀元素標(biāo)準(zhǔn)品0.2 μg，然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的供試品溶液按含量測定方法同法測定，計(jì)算回收率，由結(jié)果可知，回收率為96.79%～112.98%，RSD為8.60%(n=6)，符合規(guī)定[6]。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批號(批號：SNB-01)的樣品6份，精密稱定，消解定容后按“2.1”項(xiàng)下條件測定。計(jì)算得鈀平均含量為2.21 μg·g-1，RSD為2.40%(n=6)，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.6.5 耐用性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(批號：SNB-01)的樣品6份，其中2份于測定前2天消解，密封后冷藏保存；2份于測定前1天消解，密封后冷藏保存；另外2份測定當(dāng)天消解，6份樣品于同一天按“2.1”項(xiàng)下條件測定，觀察鈀元素穩(wěn)定性，計(jì)算得鈀平均含量為2.33 μg·g-1，RSD為4.09%，表明72小時內(nèi)，鈀元素在溶液中穩(wěn)定性能夠符合測定的要求。

2.7 樣品測定結(jié)果

按“2.1”項(xiàng)下條件測定 3 批樣品(批號：SNB-01、SNB-02、SNB-03)結(jié)果鈀元素含量分別為2.21、3.61、1.78 μg·g-1。

3 結(jié) 論

《中國藥典》2015年版尚未對鈀殘留做出限量規(guī)定，在注射劑中只是對5種重金屬進(jìn)行了限定：按每日最大使用量計(jì)算，鉛不得超過12 μg，鎘不得超過3 μg，砷不得超過6 μg，汞不得超過2 μg，銅不得超過150 μg。ICH Q3D元素雜質(zhì)指南[7]規(guī)定，鈀的安全風(fēng)險(xiǎn)等級為2B級，注射用制劑中鈀元素的PDE標(biāo)準(zhǔn)(每日允許暴露量)為10 μg·d-1；美國藥典通則 USP<232>[8]也明確規(guī)定注射用制劑中鈀元素的PDE標(biāo)準(zhǔn)(每日允許暴露量)為10 μg·d-1。舒尼鉑預(yù)計(jì)的最高臨床用量為0.1g·d-1，因此舒尼鉑原料藥的鈀含量最高限度應(yīng)為10 μg/0.1 g=100 μg·g-1。本實(shí)驗(yàn)的3批舒尼鉑原料藥中的鈀含量分別為2.21、3.61、1.78 μg·g-1，遠(yuǎn)低于這個限度，因此可以認(rèn)為舒尼鉑原料藥生產(chǎn)工藝中的鈀殘留量控制是比較成功的。

本文采用的微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法樣品消耗量低，靈敏度高，操作簡便，完全能滿足舒尼鉑原料藥中鈀殘留量控制的要求，可作為標(biāo)準(zhǔn)方法，列入相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時也可為其它類似藥物中的金屬催化劑殘留量控制提供思路。

在試驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，鉑元素在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)中存在較為嚴(yán)重的記憶效應(yīng)，如需檢測鉑含量較高的樣品，建議使用專用的樣品管、霧化器、矩管、采樣錐，并在進(jìn)樣完成后用10%的硝酸溶液沖洗進(jìn)樣通道30 min以上。