烏頭赤石脂湯對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響?

閆曉博，李予煊，陳章風(fēng)，郝佳夢，郭軍鵬，劉宏巖△

(1. 北京市朝陽區(qū)三間房社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100020； 2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

近年來，我國急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)發(fā)病率趨于上升態(tài)勢[1]，因此預(yù)防AMI的發(fā)生就成為一個重要的衛(wèi)生健康問題。細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞死亡的主要形式之一，若能有效地抑制心肌細(xì)胞凋亡，可減少心肌細(xì)胞壞死程度[2]，從而降低大面積梗死風(fēng)險。目前認(rèn)為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)在啟動細(xì)胞凋亡程序中發(fā)揮著相互制衡的調(diào)控作用。當(dāng)AMI發(fā)生之后，心肌凋亡蛋白Bcl-2和Bax動態(tài)平衡被打破，隨之可出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。因此在發(fā)病早期，及時、有效地抗凋亡可降低AMI的致殘率和死亡率。

烏頭赤石脂湯是《金匱要略》中烏頭赤石脂丸的湯劑形式。原文記載胸痹心痛重癥的特點(diǎn)是“心痛徹背，背痛徹心”[3]。依據(jù)原文對發(fā)病癥狀的描述，可將其歸于AMI范疇。臨床相關(guān)研究表明，烏頭赤石脂湯聯(lián)合丹參注射液對AMI具有顯著療效，可縮短肌酸激酶(creatine kinase,CK)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)恢復(fù)時間，降低不良反應(yīng)的發(fā)生[4-5]。藥理實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，烏頭赤石脂湯對缺血心肌的保護(hù)可能與降低血液黏稠度有關(guān)[5]，但對烏頭赤石脂湯干預(yù)AMI細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究鮮有報道。因此，本實(shí)驗(yàn)在不改變藥味組成、量效關(guān)系的基礎(chǔ)上，將烏頭赤石脂丸劑改為湯劑，并探討其對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(230±20)g，由長春市易思實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(許可證號SCXK(吉)2016-0003)，隨機(jī)分為正常組、模型組、尿激酶組和烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組，參考相關(guān)造模文獻(xiàn)[6-7]復(fù)制AMI大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)已通過長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與儀器

CTNT、CK-MK試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體、Bax兔抗大鼠多克隆抗體及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(Proteintech公司)。病理組織切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、DMLS2光學(xué)顯微鏡(德國LEICA公司)；VDS凝膠成像儀(Phamacia Biotech公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品及給藥方法

注射用尿激酶(批號H10920040)，購自南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司；注射用青霉素鈉(批號H13020657)，購自華北制藥股份有限公司；烏頭赤石脂湯所含的制川烏頭、炮附子、干姜、蜀椒和赤石脂，購自吉林省同仁大藥房。

給藥方法：每日各組大鼠治療1次，共持續(xù)1周。正常組、模型組給予等量生理鹽水；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組分別按1.12 g/只、3.36 g/只、10.08 g/只的生藥量給予湯劑治療，尿激酶組按5萬U/ml·只給予腹腔注射治療。術(shù)前3 d和術(shù)后1 d，青霉素給予皮下注射預(yù)防感染。

1.4 主要指標(biāo)及方法

1.4.1 測定CTNT、CK-MB含量 腹主動脈采集約5 ml全血，3000rpm離心15 min，取約1 ml上清液。運(yùn)用比色法，按照試劑盒說明書的操作步驟，測定各組大鼠血清中肌鈣蛋白T(troponin T,CTNT)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)含量。

1.4.2 觀察心肌病理學(xué)變化 用生理鹽水洗凈心臟后固定、脫水、包埋，切片機(jī)切約5um厚度的心肌標(biāo)本，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 檢測心肌Bcl-2、Bax表達(dá) 在左心室梗死邊緣區(qū)取約50 mg心肌組織，添加1 ml裂解液混合物，冰上持續(xù)裂解30 min,提取心肌組織蛋白，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參蛋白，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測靶蛋白Bcl-2和Bax的含量，使用VDS凝膠成像儀拍照。將GAPDH條帶灰度值計為1，計算出各組的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清CTNT、CK-MK含量變化

表1示，經(jīng)治療1周后，模型組明顯高于正常組血清CTNT及CK-MK含量(P<0.01)；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組和尿激酶組均明顯低于心梗模型組血清CTNT及CK-MK水平(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組大鼠CTNT、CK-MK、Bcl-2、Bax含量比較

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞病理形態(tài)變化

圖1示，正常組心肌細(xì)胞核完整，心肌纖維排列有序。模型組心肌細(xì)胞核基本消失，心肌纖維無序紊亂且有大量炎癥細(xì)胞浸潤。烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組和尿激酶組心肌細(xì)胞病理形態(tài)皆有明顯好轉(zhuǎn)。其中，烏頭赤石脂湯低劑量組心肌仍有少量炎性細(xì)胞散在分布和紅細(xì)胞片狀聚集；烏頭赤石脂湯中、高劑量組和尿激酶組紅細(xì)胞堆積現(xiàn)象明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，心肌纖維排列較為有序。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞病理形態(tài)變化(高倍鏡×400)

2.3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax表達(dá)變化

圖2表1示，模型組Bcl-2表達(dá)顯著低于正常組(P<0.01)，而Bax表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01)。烏頭赤石脂湯低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；烏頭赤石脂湯中、高劑量組和尿激酶組較模型組Bcl-2表達(dá)顯著升高及Bax表達(dá)顯著降低(P<0.05；P<0.01)。烏頭赤石脂湯低、中劑量組不如尿激酶組Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.01)，但高劑量組與尿激酶組無明顯差異；烏頭赤石脂湯低劑量組Bax表達(dá)明顯高于尿激酶組(P<0.01)，中、高劑量組與尿激酶組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 烏頭赤石脂湯對心梗大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，AMI的主要治療方法是藥物溶栓和介入手術(shù)，其中藥物溶栓在臨床實(shí)踐中占據(jù)重要地位。研究提示，AMI發(fā)病時溶栓越早冠脈再通率則越高[8]，但溶栓也有一定時效性。尿激酶作為第一代溶栓劑，具有較強(qiáng)的溶栓能力，但對纖維蛋白缺乏特異性，可增加全身出血、惡性心律失常等風(fēng)險。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，烏頭赤石脂湯高劑量在降低心肌酶釋放、改善心肌病理形態(tài)以及減少細(xì)胞凋亡程度方面與尿激酶相近，說明烏頭赤石脂湯高劑量與尿激酶在保護(hù)受損心肌、改善心肌功能及干預(yù)細(xì)胞凋亡方面的功效相當(dāng)。但就并發(fā)癥而言，烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組在實(shí)驗(yàn)治療周期內(nèi)均未出血，而尿激酶組在治療后第1～2天里有少量血液滲出，說明烏頭赤石脂湯的出血幾率較小。

烏頭赤石脂湯由制川烏頭、炮附子、干姜、蜀椒和赤石脂組成。制烏頭和炮附子在AMI發(fā)作時，可發(fā)揮強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗缺血等作用，干姜可改善冠脈收縮和舒張功能，及時緩解急性心肌缺血缺氧的狀態(tài)[9-10]。蜀椒色赤入血?dú)w于心，可引方中諸藥直達(dá)病所[11]，且有一定抗血栓作用。4藥相合可加速恢復(fù)受損心肌的生理功能，緩解急性發(fā)作時的劇痛程度以及改善梗死相關(guān)冠脈的血液供應(yīng)。赤石脂味酸澀、性甘溫，不僅能補(bǔ)心養(yǎng)血、固澀虛陽，還能斂辛散之性、抑毒性吸收[12-13]。現(xiàn)代藥理證實(shí)，赤石脂具有止血和抗血栓的作用[14]，提示赤石脂不僅能確保余藥溫通心脈，還可防離經(jīng)之血產(chǎn)生，全方對AMI起干預(yù)作用的關(guān)鍵在于通心脈、防瘀阻，以降低梗死風(fēng)險度。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究的初步結(jié)論是在療效相近的前提下，烏頭赤石脂湯高劑量組的出血風(fēng)險更小，使用安全性更高。因此，若將烏頭赤石脂湯高劑量制備成舌下含服或靜脈滴注等劑型，進(jìn)一步提高生物利用度，以保證快速吸收入血，可縮短心肌總?cè)毖獣r間，降低心肌梗死的程度。其內(nèi)在機(jī)理可能與上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax有關(guān)，但最終是依賴激活caspase通路還是非caspase通路尚需進(jìn)一步的深入研究。