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    逆灸足三里抗自然衰老大鼠皮膚老化的研究?

    2020-08-27 07:04:02陳友義
    關(guān)鍵詞:雌二醇膠原蛋白艾灸

    張 苗,紀(jì) 峰,陳友義

    (福建中醫(yī)藥大學(xué), 福州 350112)

    隨著人口老齡化日趨明顯,衰老成為目前人們研究的熱門。衰老被認(rèn)為是生理功能的衰退或惡化,通常由于基因組的累計(jì)變化,端粒長度的減少,蛋白質(zhì)和細(xì)胞損傷,炎癥和細(xì)胞衰老,內(nèi)源性干細(xì)胞的耗盡[1],導(dǎo)致皮膚老化的原因很多,包括紫外線(UV)損傷、環(huán)境污染、炎癥、活性氧的增加以及衰老[2-3]??偟膩碚f,這些不同來源造成的損害會(huì)導(dǎo)致表皮組織的退化和損傷以及膠原蛋白和彈性蛋白的喪失,其中衰老也被認(rèn)為是表皮厚度和生長因子下降的主要原因[4],同時(shí)皮膚衰老與氧化過程也存在關(guān)系。

    “治未病”是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要組成部分,對后世影響深遠(yuǎn)。逆灸是指在機(jī)體無病或疾病發(fā)生之前,預(yù)先應(yīng)用針灸方法激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,增強(qiáng)機(jī)體的抗病與應(yīng)變能力,從而防止疾病的發(fā)生、減輕隨后疾病的損害或保健延年的傳統(tǒng)方法。依據(jù)疾病預(yù)防原則而應(yīng)用逆灸的手段來“治未病”是針灸學(xué)的重要內(nèi)容。足三里穴是常用的保健要穴,是足陽明胃經(jīng)的合穴、胃之下合穴、回陽九針穴之一?!夺樉恼嫠琛吩唬骸叭镳B(yǎng)后天之氣,灸三里可使元?dú)獠凰?,故稱長壽之灸。[5-6]”

    本實(shí)驗(yàn)選取自然衰老大鼠模型,采用目前艾灸動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中普遍采用的方法,觀察艾灸足三里對皮膚抗老化能力的影響,以期為檢驗(yàn)古方、指導(dǎo)臨床提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑

    S-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司);FS-200塑料薄膜封口機(jī)(臨安銘偉包裝機(jī)械設(shè)備廠);Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽(BIO-RAD公司);NanoDrop 2000c微量分光分度計(jì)(美國ThermoFisher公司);CKX 41實(shí)驗(yàn)室倒置生物顯微鏡(日本OLYMPOS公司);SOD和MDA試劑盒(南京建成);collagenⅠ/Ⅲ抗體(華安生物);RIPA裂解液(上海生物工程股份公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)SD雌性健康大鼠48只,其中青年組6只,3月齡,體質(zhì)量(200±20)g;10月齡42只,體質(zhì)量(400±220)g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為10個(gè)月、12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月對照組以及12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月艾灸組,每組各6只;各組動(dòng)物在同等條件下常規(guī)喂食,放置光照充足、通風(fēng)良好的地方,溫度保持在(24±2)℃,濕度保持在40%~60%。

    1.3 取穴及艾灸方法

    艾灸組每周灸足三里4次,持續(xù)2個(gè)月、4個(gè)月和6個(gè)月,對照組每周相同時(shí)間抓取但不灸,亦不讓其聞到艾灸的味道。

    大鼠足三里穴定位參照大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜。足三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約5 mm處。艾灸前將穴區(qū)直徑約1.0 cm左右的鼠毛剪干凈,用大鼠固定器將大鼠固定,暴露穴區(qū)皮膚。艾柱底盤直徑為0.7 cm,艾柱直徑為0.1 cm,重1.0 g,將艾柱黏貼在穴區(qū),小孔對準(zhǔn)穴位點(diǎn)燃艾柱,每次灸10 min,灸后局部皮膚略紅,無發(fā)泡。

    1.4 取材及標(biāo)本處理

    大鼠于3、10、12、14、16月齡分別取材。取材前1 d用配置的8%硫化鈉溶液脫去兩肩胛至髂骨之間背部皮膚的毛。第2天大鼠處死后,剪取大鼠背部脫毛皮膚適量分成三部分:第一部分皮膚置于中性多聚甲醛中固定,24 h后常規(guī)脫水、透明、封片;第二部分皮膚用預(yù)冷生理鹽水(4 ℃)沖洗,除凈雜質(zhì),濾紙拭干,切取皮膚0.5 g放入盛有2.0 mL預(yù)冷生理鹽水的小燒杯內(nèi),剪碎后制成10%勻漿;第三部分用錫箔紙包好放入液氮中,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    圖1 各組大鼠皮組織H&E染色(×100)

    1.5 H&E染色檢測皮膚病理變化

    將新鮮的皮膚組織浸泡于4%的中性多聚甲醛包埋于蠟塊中,切片徹底脫蠟后進(jìn)行H&E染色。

    1.6 ELISA法檢測大鼠皮膚勻漿中雌二醇水平

    準(zhǔn)確稱取3、10、12、14、16月齡皮膚質(zhì)量,按體質(zhì)量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的PBS,冰水浴條件下機(jī)械勻漿制備成10%的勻漿液,2500~3000 r/min離心10 min,去上清按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.7 皮膚組織MDA含量測量

    MDA(丙二醛)是常用的過氧化標(biāo)志物,在高溫和酸性條件下可與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅棕色的三甲川,其生成物在532 nm 處有最大吸收波長。準(zhǔn)備足夠多的1.5 mL EP管,按MDA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.8 皮膚組織SOD活力測量

    SOD(超氧化物歧化酶)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,廣泛分布于各種生物體內(nèi)如動(dòng)物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性,是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo),按SOD試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.9 qPCR檢測多種生長因子表達(dá)水平

    取各組大鼠皮膚組織,使用Trizon試劑提取皮膚RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR檢測VEGF、EGF、TGF-β、ERβ、bFGF的基因表達(dá)水平。引物序列如下:VEGF: F:5’-GCACTGGACCCTGGCTTTACT-3’, R:5’-ACTTCACCACTTCATG GGCTTTCTG-3’; EGF: F:5’-TCGGTGCTGTGCGATTTA-3’, R:5’-TTTCTGGCAGTTCTCCTC-3’; TGF-?1 F: 5’-ACTACGCCAAAGAAGTCACC-3’,R: 5’-CACTGCTTCCCGAATGTCT-3’; FGF F: 5’-ATTTCCAAAACCTGACCCGAT-3’, R: 5’-TGCCTTTTAACACAACGACCAG-3’。

    1.10 Western Blot 檢測膠原蛋白表達(dá)水平

    Western Blot檢測膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的蛋白含量:一是清洗玻璃板并安裝好,然后灌水檢漏、配膠;二是電泳:以濃縮膠電壓為70 V和分離膠電壓為120 V的條件進(jìn)行電泳;三是將膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上;本是封閉1~2 h后用一抗過夜孵育,然后用TBST洗膜3次,每次10 min,用二抗孵育1~2 h,再用TBST洗膜3次,每次10 min,最后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 艾灸具有保護(hù)大鼠皮膚的作用

    圖1示,組織病理學(xué)可以客觀真實(shí)地反映組織損傷的嚴(yán)重程度。3個(gè)月青年組、10個(gè)月對照組和12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月艾灸組表皮、真皮結(jié)構(gòu)及毛囊完好無損,而12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月衰老組大鼠隨著年齡的增加,表皮細(xì)胞和毛囊上皮細(xì)胞腫脹,核固縮,存在充血性血管反應(yīng)和炎癥細(xì)胞浸潤。

    圖2示,皮膚馬松染色反映皮膚中膠原蛋白的含量,3個(gè)月青年組、10個(gè)月對照組和12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月艾灸組膠原蛋白含量多,排列整齊;12個(gè)月、14個(gè)月、16個(gè)月衰老組膠原纖維性水腫導(dǎo)致排列紊亂,以上結(jié)果說明艾灸具有保護(hù)大鼠皮膚的作用。

    注:箭頭所示為膠原蛋白圖2 各組大鼠皮膚組織馬松染色結(jié)果(×100)

    2.2 艾灸對皮膚的氧化應(yīng)激、含水量、雌二醇含量及膠原蛋白表達(dá)的影響

    表1示,衰老會(huì)伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,通過檢測抗氧化標(biāo)志物過氧化物歧化酶(SOD)和氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)來研究艾灸對氧化應(yīng)激的影響。艾灸可以增加皮膚中SOD的活力,減少M(fèi)DA的含量(P<0.05),說明艾灸可以減少衰老帶來的皮膚氧化。

    皮膚干濕重比值與皮膚含水量和通透性有很大的關(guān)系,皮膚的衰老也會(huì)直接導(dǎo)致皮膚含水量下降。表1可知,與衰老各組大鼠比較,艾灸各組大鼠的皮膚含水量顯著性增加(P<0.05),說明艾灸增加皮膚含水量和通透性達(dá)到減緩衰老的作用。

    皮膚的衰老與雌二醇的下降有很大的關(guān)系,通過ELISA檢測皮膚勻漿中雌二醇的表達(dá)量,從表1可以看出,3個(gè)月青年組和10個(gè)月對照組的雌二醇含量比較高,隨著年齡的增加,雌二醇的含量有顯著性下降;而各艾灸組大鼠皮膚的雌二醇含量相比于同月齡對照組有所增加(P<0.05),說明艾灸可以通過增加皮膚雌二醇含量減緩衰老。

    皮膚膠原蛋白的含量也是檢測皮膚衰老的一個(gè)重要指標(biāo),嬰兒及青年人皮膚Ⅲ型膠原含量約占70%,Ⅰ型膠原蛋白占30%。當(dāng)皮膚衰老時(shí),兩者比例逐漸倒置,膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降,抗剪切力減弱。通過Western Blot 檢測皮膚中膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ的含量,從表1可以看出,3個(gè)月青年組和10個(gè)月對照組的膠原蛋白Ⅲ含量很高,膠原蛋白Ⅰ含量很少,與各衰老組比較,艾灸可以顯著性增加皮膚膠原蛋白Ⅲ的含量(P<0.05),說明艾灸通過增加皮膚膠原蛋白Ⅲ的含量減緩皮膚衰老。

    表1 各組大鼠皮膚組織雌二醇含量、干濕重比值、膠原蛋白含量、SOD活力和MDA含量比較

    2.4 艾灸對皮膚中生長因子含量的影響

    表2示,皮膚中的生長因子與皮膚衰老也有很大的關(guān)系,通過qPCR檢測各組大鼠生長因子VEGF、EGF、TGF-β、Erβ和bFGF mRNA的表達(dá)水平,3個(gè)月青年組和10個(gè)月對照組各種生長因子表達(dá)量較高,隨著年齡的增加生長因子表達(dá)量下降;經(jīng)艾灸治療的老齡鼠生長因子的表達(dá)有所升高(P<0.05),說明艾灸可以增加皮膚中生長因子的含量。

    表2 各組大鼠皮膚組織生長因子mRNA表達(dá)水平比較

    3 討論

    中醫(yī)傳統(tǒng)理論謂之“美容顏”“好顏色”“健肌膚”“駐顏”“烏須發(fā)”“耐老”等。延緩皮膚水牢屬于中醫(yī)“養(yǎng)生”學(xué)范疇。中醫(yī)對皮膚衰老的研究存在以下機(jī)理:“以腎為本,注重五臟”“氣血津液,密切相關(guān)”“六淫七情,亦可致衰”。張仲景在《金匱要略》中提出:“夫治未病者,見肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”。因此,“治未病”應(yīng)包含未病先防、早期治療、已病防變等涵義。它的最終目的應(yīng)是防病防變、保健延年。逆針灸一詞首見明·高武《針灸聚英》:“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也”。 金曉哲等[14-15]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,針刺足三里能提高光老化模型大鼠皮膚組織中SOD的活性,對紫外線照射引起的無毛鼠皮膚光老化具有保護(hù)作用。華巖等[16]探討艾灸足三里穴對小鼠腎臟組織抗氧化損傷的影響,發(fā)現(xiàn)能提高骨骼肌組織中GSH-Px、SOD的活性,清除自由基,阻止加快的過氧化反應(yīng)。白巍等[17]實(shí)驗(yàn)表明,針刺足三里、關(guān)元穴能明顯增強(qiáng)更年期雌性大鼠卵巢組織抗氧化、清除自由基的能力,改善和調(diào)節(jié)卵巢生理功能,從而延緩卵巢的衰老進(jìn)程。楊春英等[18]針灸亞急性衰老模型小鼠足三里后,小鼠皮膚組織中的丙二醛(MDA)含量減少,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力增強(qiáng),羥脯氨酸(Hyp)含量增多,提示針灸足三里穴對小鼠皮膚衰老具有拮抗作用。研究表明[19],針灸衰老模型小鼠的足三里穴,能提高機(jī)體自身抗自由基氧化損傷的能力,減輕淋巴細(xì)胞DNA的損傷程度,使小鼠腦組織Bcl-2基因表達(dá)上調(diào),抑制細(xì)胞凋亡,減少皮膚組織中的丙二醛(MDA)含量,增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力,增多羥脯氨酸(Hyp)含量,從而達(dá)到延緩衰老的目的。

    在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究中,皮膚的老化過程中有多種生長因子如VEGF、EGF、TGF-β、FGF等起著重要的保護(hù)和修復(fù)作用[7]。皮膚衰老研究證實(shí),膠原是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,膠原纖維約占真皮纖維的90%。研究表明,隨著年齡增長,皮膚膠原纖維變細(xì),真皮層變薄。一般嬰兒及青年人皮膚Ⅲ型膠原含量約占70%,Ⅰ型膠原蛋白占30%。 當(dāng)皮膚衰老時(shí)兩者比例逐漸倒置,膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降,抗剪切力減弱[14]。 膠原蛋白總含量減少,特別是可溶性膠原含量下降明顯,同時(shí)真皮乳頭層和網(wǎng)狀層彈性纖維減少及退化,膠原纖維和彈性纖維排列也漸趨紊亂,引起皺紋、松弛及下垂[8-9]。雌激素參與了皮膚的許多生理及病理過程,人類皮膚老化與體內(nèi)性激素水平降低有關(guān)。絕經(jīng)期出現(xiàn)卵巢周期性排卵及激素周期終止,雌激素下降明顯,由原來的0.350 mg/d下降至0.045 mg/d,絕經(jīng)期婦女由于卵巢的內(nèi)分泌功能減退,血中雌二醇(E2)水平下降90%,雌酮(E1)下降50%[10]。脫氫表雄酮及硫酸脫氫表雄酮逐步下降,最終導(dǎo)致卵巢基質(zhì)耗竭(70歲左右)[11-12]。正常皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)雌激素受體(ER),雌激素可直接調(diào)控該細(xì)胞的增殖,提高其活性,增加膠原含量[13]。

    本實(shí)驗(yàn)在衰老大鼠模型中,利用艾灸進(jìn)行治療可以明顯緩解老齡大鼠的皮膚衰老。通過H&E和馬松染色在組織病理學(xué)方面發(fā)現(xiàn),艾灸可以保護(hù)表皮和真皮結(jié)構(gòu)以及毛囊的完整性;通過檢測SOD活力和MDA含量發(fā)現(xiàn),艾灸在衰老的皮膚中具有抗氧化的作用,抑制氧化應(yīng)激從而達(dá)到保護(hù)皮膚的作用;qPCR和ELISA的方法檢測大鼠皮膚組織中生長因子和雌二醇的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),艾灸可以有效地增加多種生長因子和雌二醇的含量,說明艾灸通過增加生長因子和雌二醇的含量來延緩大鼠皮膚衰老;最后利用Western Blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證艾灸可以有效地促進(jìn)皮膚組織中膠原蛋白表達(dá)。

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)說明艾灸可以降低皮膚的炎癥和氧化水平,增加衰老皮膚的膠原蛋白含量和雌二醇水平。本實(shí)驗(yàn)艾灸組共分為逆灸2個(gè)月、4個(gè)月和6個(gè)月3組。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,逆灸2個(gè)月后皮膚的衰老程度具有輕微延緩,逆灸4個(gè)月時(shí)老齡大鼠皮膚的衰老程度具有顯著性緩解,逆灸6個(gè)月與4個(gè)月無明顯變化,說明逆灸4個(gè)月就已經(jīng)足夠緩解老齡鼠的皮膚衰老程度,本實(shí)驗(yàn)為臨床緩解皮膚衰老提供了新的方法與思路。

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