食用菌中硫酸鏈霉素殘留的免疫快速檢測

柳雙，王敏思，謝春花，周永斌，柳桃，宋洋，*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.天津市林業(yè)果樹研究所，天津300384；3.中延菌菇業(yè)（天津）有限公司，天津301600）

硫酸鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基酸糖苷類抗生素藥物[1]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，分子量為728.7，是鏈霉素的硫酸鹽形式。鏈霉素對結(jié)核桿菌具有強(qiáng)大的抗菌作用[2]，對多數(shù)革蘭陽性球菌和桿菌的抗菌作用不強(qiáng)，對許多革蘭陰性桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用，曾被廣泛用于結(jié)核病的治療。在農(nóng)業(yè)方面，硫酸鏈霉素可作為一種廣譜抗菌素藥劑[3]，應(yīng)用于食用菌栽培及果蔬病害防治，可用于促進(jìn)木耳菌絲生長[4-5]；抑制食用菌培養(yǎng)基中雜菌的生長[6]；防控食用菌栽培中的軟腐病[7]、細(xì)菌性腐爛以及治療平菇銹斑病[8]、紅銀耳病、大白菜軟腐病、水稻白葉枯病、棉花立枯病、瓜類霜霉病等[9]。隨著硫酸鏈霉素在農(nóng)業(yè)中的大量使用，農(nóng)產(chǎn)品中的硫酸鏈霉素藥物滯留和蓄積，并以食物鏈方式進(jìn)入人體，危害人類健康[10]。硫酸鏈霉素及其衍生物有嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性，長期攝入有鏈霉素殘留的食物會造成腎臟及前庭功能和耳蝸神經(jīng)永久性損傷[3]；食物中殘留的硫酸鏈霉素可能會造成過敏反應(yīng)甚至引起休克[11]；研究表明硫酸鏈霉素還具有潛在的致畸作用[12]。因此在臨床上逐漸被其他效果類似的藥物所取代，但在農(nóng)藥方面仍在繼續(xù)利用[13]。

圖1 硫酸鏈霉素結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of streptomycin

目前，硫酸鏈霉素在我國及日本等多個國家（地區(qū)）均允許使用，但由于其對人體的危害性，我國及世界各國對其殘留限量作出規(guī)定，其中我國農(nóng)業(yè)部及歐盟國家僅規(guī)定了動物源食品中硫酸鏈霉素的最高殘留限量[14-15]；僅日本肯定列表中規(guī)定了植物源食品中的硫酸鏈霉素殘留限量，如白菜/大蒜和茄科蔬菜中硫酸鏈霉素的最高殘留限量分別為50 μg/kg和300 μg/kg。國內(nèi)外針對于動物源性食品中硫酸鏈霉素殘留檢測的研究較多，且以色譜方法為主。但儀器方法存在成本高，自動化程度低等問題[16]。近年來，免疫分析方法因其簡單、快速等特點被建立并廣泛應(yīng)用。2011年N.A.Byzova等[17]建立了膠體金免疫層析試紙條的方法檢測牛奶和酸奶中硫酸鏈霉素殘留，其檢測范圍在16 ng/mL～250 ng/mL，樣品無需處理即可稀釋用于檢測，與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 相關(guān)性為 0.935；2013 年奚茜等[18]建立了直接競爭ELISA檢測牛奶和蜂蜜中硫酸鏈霉素殘留的方法，該方法IC50值為3.60 ng/mL，樣品經(jīng)提取、凈化、干燥等處理后稀釋用于檢測，與液相色譜（liquid chromatography，LC）方法的相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.97；2019年Wei等[19]建立了視覺雙點免疫分析法同時檢測牛奶中硫酸鏈霉素和卡那霉素殘留的方法，樣品經(jīng)簡單除脂后稀釋用以檢測，該方法肉眼檢測限為12.5 ng/mL，回收率為93.3%～124.5%，并可進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，食用菌的安全問題得到重視。由于硫酸鏈霉素可應(yīng)用于食用菌軟腐病和細(xì)菌感染等疾病的防控，因此建立針對食用菌中硫酸鏈霉素殘留建立快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)至關(guān)重要。本試驗基于硫酸鏈霉素單克隆抗體，經(jīng)簡單快速的樣品前處理及反應(yīng)條件優(yōu)化，建立食用菌中硫酸鏈霉素殘留間接競爭ELISA檢測方法，并對25個樣品進(jìn)行實際樣品檢測，對于實現(xiàn)食用菌中硫酸鏈霉素的高效、快速檢測具有重要的意義，為針對食用菌的硫酸鏈霉素檢測試劑盒的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸鏈霉素：河北百靈威超精細(xì)材料有限公司；酶標(biāo)二抗（羊抗鼠）：中國上海斯信生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：生工生物工程上海股份有限公司；β-環(huán)糊精：德國Merck公司；過氧化氫脲：美國 Sigma公司；3，3’，5，5’—四甲基聯(lián)苯胺（3.3.5.5Tetramethylbenzidine，TMB）：美國 Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：中國 J＆K公司；NaH2PO4·2H2O：天津金海華興科技發(fā)展有限公司；Na2HPO4·12H2O：天津市大茂化學(xué)試劑廠；NaCl、乙酸鈉、硫酸（分析純）：中國天津市化學(xué)試劑供銷公司；檸檬酸：成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；三氯乙酸：天津市津科精細(xì)化工研究所；樣品：市售。

pH 9.6碳酸鈉緩沖液（包被緩沖液）；0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.4（phosphate buffer，PBS）；1L PBS 加0.5 g吐溫（PBS-tween-20，PBST）；100 mLPBS+0.1 g BSA（PBS-BSA，PBSB）；6 mg/mL硫酸鏈霉素單克隆抗體：天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite 200全波長酶標(biāo)儀：英國雷勃公司；96孔酶標(biāo)板：丹麥Nunc公司；GHP-9050恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RH-KT加熱磁力攪拌器、MTS2/4數(shù)顯型酶標(biāo)板振蕩器：德國IKA公司；H1650離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XH-C渦旋儀：上海聯(lián)廣認(rèn)證有限公司；XBLL-23A多功能食品加工機(jī)：中國帥佳電子科技有限公司。

1.3 硫酸鏈霉素間接競爭ELISA方法的建立

利用間接競爭ELISA法，具體方法參考自Song等[20]，酶標(biāo)二抗稀釋5 000倍，分別將包被原用包被液配制成 0.01、0.05、0.1 μg/L；將緩沖液離子濃度調(diào)為：10、20、30、40、50 mmol/L 用以稀釋抗體、酶標(biāo)二抗及硫酸鏈霉素標(biāo)品；將緩沖液的pH值分別調(diào)成：4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5，用以稀釋抗體、酶標(biāo)二抗及硫酸鏈霉素標(biāo)品；將競爭反應(yīng)時間分別設(shè)置為 25、40、55、70 min。反應(yīng)在96孔酶標(biāo)滴定板中進(jìn)行，用酶標(biāo)儀讀取A450 nm和A650 nm值，最后根據(jù)結(jié)果中IC50值的大小和吸光度的變化選擇最佳反應(yīng)條件。

利用以上優(yōu)化條件，將硫酸鏈霉素配制成濃度為0.07、0.22、0.67、2.00、6.00、18.00 μg/kg 的溶液，進(jìn)行間接競爭ELISA試驗。試驗結(jié)果以硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（μg/kg）為橫坐標(biāo)，以抑制率（%）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：A質(zhì)控為硫酸鏈霉素標(biāo)品濃度為零時的吸光度；Ax為硫酸鏈霉素標(biāo)品濃度為x時的吸光度；A空白為空白孔的吸光度。

1.4 抗體特異性的評估

通過抗原以及其他抗原結(jié)構(gòu)類似物與抗體的交叉反應(yīng)率來判斷抗體的特異性[21]。

式中：IC50(硫酸鏈霉素)為硫酸鏈霉素的抑制率為 50%時所對應(yīng)的硫酸鏈霉素濃度；IC50(其他標(biāo)準(zhǔn)品)為其他標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率為50%時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.5 樣品的測定

1.5.1 樣品的準(zhǔn)備與處理

分別選擇5種食用菌（平菇、杏鮑菇、雙孢菇、猴頭菇、香菇）作為樣品去評估間接競爭ELISA方法的各項性能指標(biāo)。樣品經(jīng)HPLC-MS檢測確保其不含硫酸鏈霉素和雙氫鏈霉素。將樣品的子實體部分用食品加工機(jī)切碎，儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 基質(zhì)影響的消除

稱取1g經(jīng)粉碎的樣品，加入2mLPBS，渦旋5min，離心（5 000 r/min），取1 mL上清液加入1 mL 5%三氯乙酸溶液，渦旋5 min，離心，取上清液。處理后的樣品液體儲存于棕色小瓶中-20℃?zhèn)溆茫镁彌_液稀釋即可進(jìn)行ELISA檢測。

1.5.3 添加回收試驗

本研究利用添加回收試驗評估了方法的準(zhǔn)確度。具體步驟如下：利用5種食用菌樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每種樣品分別添加 3 個濃度（15、65、150 μg/kg），每個濃度重復(fù)3次，樣品提取液經(jīng)間接競爭ELISA法分別檢測后，計算其回收率，根據(jù)回收率接近100%的程度來檢驗方法的準(zhǔn)確度。

1.5.4 實際樣品的檢測

對平菇、杏鮑菇、香菇、雙孢菇及猴頭菇進(jìn)行抽樣調(diào)查，每種抽取5個樣品進(jìn)行檢測。

1.6 與HPLC-MS比對試驗

檢測條件及方法參考標(biāo)準(zhǔn)方法：GB/T 22995-2008《蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[22]。

樣品提取與凈化方法同1.5.2，處理后的樣品液體過0.22 μm水系濾膜后即可進(jìn)行HPLC-MS檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接競爭ELISA法的建立

經(jīng)優(yōu)化了包被原包被量、緩沖液液離子濃度、pH值以及競爭反應(yīng)時間，最終確定的的最優(yōu)條件為：抗體稀釋108 000倍；包被原包被量為0.5 μg/well；緩沖液為10 mmol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液；抗原抗體競爭反應(yīng)時間為55 min。繪制緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，IC15=（0.20 ±0.05）μg/L，IC50=（0.87±0.15）μg/L，線性范圍為 0.25 μg/L～4.25 μg/L（抑制率為 20%～90%所對應(yīng)的硫酸鏈霉素濃度）。

圖2 硫酸鏈霉素抑制曲線Fig.2 Streptomycin sulfate inhibition curve

2.2 抗體特異性

利用間接競爭ELISA測定抗體與硫酸鏈霉素及其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)來評價抗體的特異性見表1。

表1 各化合物與抗體的交叉反應(yīng)率和IC50值Table 1 The IC50and coefficient of variation of compounds

由表1可知，該抗體可以特異性的識別硫酸鏈霉素，且對其類似物雙氫鏈霉素有極高的交叉反應(yīng)（98.9%），而與其他抗生素如慶大霉素、卡那霉素、氯霉素等的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。

2.3 硫酸鏈霉素間接競爭ELISA的校正曲線及基質(zhì)曲線

取5種食用菌樣品進(jìn)行處理，將獲得的樣品提取液經(jīng)PBS稀釋20倍后的溶液作為硫酸鏈霉素標(biāo)品的稀釋液，經(jīng)間接競爭ELISA檢測獲得的抑制率曲線即為樣品的基質(zhì)曲線，結(jié)果如圖3、表2所示，5種樣品的基質(zhì)曲線與校正曲線幾乎重合。

圖3 硫酸鏈霉素間接競爭ELISA校正曲線（以杏鮑菇為例）Fig.3 Indirect competitive ELISA calibration curve of streptomycin sulfate（taking pleurotus eryngium as an example）

表2 硫酸鏈霉素間接競爭ELISA法校正曲線與各樣品的基質(zhì)曲線的比較Table 2 Comparison of indirect competitive ELISA calibration curves of streptomycin with matrix curves of each sample

由表2可知，樣品的前處理方法完全可以達(dá)到消除基質(zhì)影響的目的，且該校正曲線至少可以用于這5種樣品的硫酸鏈霉素殘留檢測。

2.4 添加回收試驗

將5種食用菌樣品勻漿分別添加3個水平（15、65、150 μg/kg）的硫酸鏈霉素標(biāo)品，每個水平設(shè)置 3個平行，25℃靜置30 min，分別處理樣品，獲得提取液，經(jīng)PBS稀釋80倍后用于間接ELISA檢測，結(jié)果如表3所示。其中，回收率為88.5%～99.5%，在誤差允許內(nèi)，且變異系數(shù)小于7.5%。

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

本試驗對平菇、杏鮑菇、香菇、雙孢菇及猴頭菇進(jìn)行抽樣調(diào)查，每種抽取5個樣品進(jìn)行檢測。實際樣品中的硫酸鏈霉素的檢測見表4。

由表4可知，在杏鮑菇、平菇、雙孢菇、香菇中均檢出硫酸鏈霉素，其結(jié)果與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法一致。

表3 硫酸鏈霉素在5種樣品中的添加回收率Table 3 Recovery of Streptomycin in 5 Samples

表4 實際樣品中的硫酸鏈霉素的檢測Table 4 Detection of streptomycin in real samples

3 結(jié)論與展望

本研究基于間接競爭ELISA方法，建立了一種快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測食用菌中硫酸鏈霉素殘留的方法。其中，樣品僅需簡單提取和酸化即可基本消除基質(zhì)影響并用于間接競爭ELISA檢測。實現(xiàn)了食用菌中硫酸鏈霉素殘留的快速檢測。由于目前僅日本肯定列表中規(guī)定了部分植物源性食品中硫酸鏈霉素的最大殘留限量，未規(guī)定食用菌中硫酸鏈霉素的最大殘留限量，因此該結(jié)果對完善我國國家標(biāo)準(zhǔn)中食用菌中硫酸鏈霉素的殘留限量提供一定的數(shù)據(jù)支持。