神農(nóng)架林區(qū)中蜂蜜理化指標(biāo)及抗氧化活性分析

蔡雨嬌，孫麗萍，*，張雪琦，5

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，北京100093；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京100093；5.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南?？?70100）

蜂蜜是一種天然食品，主要由糖和其他活性成分組成，如酶、氨基酸、有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)和芳香物質(zhì)等。它富含酚酸類（如苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸）和黃酮類（如山奈酚、短葉松素、白楊素）化合物[1]，具有廣泛的生物利用價值，如：抗氧化[2]、抗炎[3]、抑菌[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、抗癌[7]等。中蜂蜜是中華蜜蜂（Apis cerana）采集野山花蜜充分釀制而成的蜂蜜，其色澤深、口味獨(dú)特、香甜味濃，含有多種能被人體直接吸收的微量元素[8]。古代醫(yī)學(xué)家李時珍在《本草綱目》中記述其對人體健康有益，是藥引的首選蜜，堪稱“蜜中精品”[8-9]。

近年來，國內(nèi)外對意蜂蜂蜜的化學(xué)組成及抗氧化活性的研究報道較多，而對中蜂蜂蜜的研究報道相對較少。湖北省是中國養(yǎng)蜂業(yè)比較發(fā)達(dá)、蜂群飼養(yǎng)量較大的省份之一，飼養(yǎng)的蜂種既有意大利蜜蜂，也有中華蜜蜂。而神農(nóng)架林區(qū)是湖北省唯一沒有飼養(yǎng)西方蜜蜂的行政區(qū)域。關(guān)于神農(nóng)架林區(qū)中蜂蜜的研究罕見報道，本試驗(yàn)選擇了神農(nóng)架林區(qū)5個區(qū)域所產(chǎn)的中蜂蜜為試驗(yàn)材料，對其理化指標(biāo)以及總酚酸、總黃酮含量和自由基清除能力進(jìn)行了測定，并對各指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，豐富中蜂蜜的研究內(nèi)容，旨在為神農(nóng)架林區(qū)中蜂蜜的開發(fā)利用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用樣品為采自神農(nóng)架林區(qū)的5個中蜂蜜，11-1#、11-3#和11-4#采集自紅坪鎮(zhèn)（分別產(chǎn)自紅坪鎮(zhèn)高坪村、紅坪鎮(zhèn)紅舉村、紅坪鎮(zhèn)板包村），11-2#采集自松柏鎮(zhèn)掌坊村。11-5#采集自宋洛鄉(xiāng)，采集后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑：北京索萊寶科技有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Costar公司；甲醇（色譜純）：Fisher公司；無水乙醇、乙酸乙酯（均為分析純）：北京化工廠；結(jié)晶氯化鋁、過硫酸鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli－Q超純水儀：默克密理博公司；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒－托利多公司；UV－2550紫外－可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Synergy ne02酶標(biāo)儀：BioTek美國伯騰儀器有限公司；微量移液器：德國Eppendorf公司；LC－20AD高效液相色譜儀：日本島津公司；WAYY18阿貝折光儀：上海精密科學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測定

葡萄糖、果糖含量測定參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》（GB 5009.8-2016）：采用HPLC法進(jìn)行測定，氨基色譜柱：4.6 cm×250 mm，流動相為超純水 ∶乙腈=3 ∶7，流速為1 mL/min。檢測器溫度為40℃；進(jìn)樣量為15 μL。

酸度測定參照GH/T1141-2017《蜂蜜及其制品酸度的測定-電位滴定法》，水分測定參照SN/T 0852-2012《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》、淀粉酶值測定參照GB/T 18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的測定方法-分光光度法》、羥甲基糠醛的檢測參照GB/T 18932.18-2003《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定方法-液相色譜-紫外檢測法》。

1.3.2 總酚酸含量的測定

總酚酸含量的檢測方法采用Folin-Ciocalteu法[10]，準(zhǔn)確稱取3 g蜂蜜樣品，加超純水超聲溶解、混勻，定容至10 mL。8 000 r/min離心后吸取1 mL上清樣液于5 mL容量瓶中，加超純水3 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteu顯色劑0.25 mL，混勻后靜置5 min，然后加入20%的Na2CO3溶液0.75 mL，超純水稀釋定容混勻后室溫下避光靜置30 min。取0.1 mL反應(yīng)液于96孔板中，在波長763 nm處測定吸光度，平行測定3次。以沒食子酸（quercetin equivalent，QE）為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總酚酸的含量。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的檢測方法采用三氯化鋁比色法[11]并適當(dāng)調(diào)整。準(zhǔn)確稱取10.0 g蜂蜜樣品，加超純水溶解，超聲后定容至10 mL，混勻8 000 r/min離心后量取3 mL～4 mL上清液，加1%AlCl3乙醇溶液1.0 mL，用95%乙醇稀釋定容、搖勻，靜置10 min。吸取0.1 mL反應(yīng)液于96孔板中，在波長405 nm處測定吸光值，平行測定3次。以蘆丁當(dāng)量（rutinum equivalent，RE）為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蜂蜜樣品中總黃酮的含量。

1.3.4 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照楊佳林等[12]的方法，經(jīng)過適當(dāng)?shù)男薷摹?00 μL不同濃度的蜂蜜水溶液中加入100 μL 0.08 mg/mL DPPH乙醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），混合均勻，室溫25℃下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度，記為A1。同時以100 μL DPPH溶液與100 μL乙醇溶液混合后的吸光度作為樣品空白對照，記為 A2，以 100 μL 乙醇與 100 μL 蜂蜜水溶液混合后的吸光度記為溶劑空白對照，記為A0，平行測定3次。以試樣質(zhì)量濃度和清除率計(jì)算其半抑制濃度（IC50值）。DPPH·清除率/%=[1-（A1-A0）/A2]×100。

1.3.5 ABTS+自由基清除能力測定

ABTS+自由基清除能力參照Re等的方法[13]，不同濃度的蜂蜜水溶液按體積比1∶4分別加入ABTS+工作液，混合均勻后靜置6 min，于734 nm波長處測定吸光度，記為A1；同時以ABTS+工作液與無水乙醇溶液按體積比4∶1混合后的吸光度作為樣品空白對照，記為A2；以無水乙醇與蜂蜜樣品水溶液按4∶1混合后的吸光度作為試劑空白對照，記為A0，平行測定3次。以試樣質(zhì)量濃度和清除率計(jì)算其半抑制濃度（IC50值）。ABTS+·清除率/%=[1-（A1-A0）/A2]×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均測定3個平行，結(jié)果以平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析均采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

神農(nóng)架林區(qū)5個中蜂蜜樣品的理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

表1 5種中蜂蜜樣品理化指標(biāo)比較Table 1 Chemical and physical indices comparison of five Apis cerana honeys

蜂蜜中的水分含量是評價蜂蜜質(zhì)量的一個重用指標(biāo)，可以用來判斷蜂蜜是否達(dá)到自然成熟[14-15]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定優(yōu)級蜜的水分含量低于20%，合格蜜水分含量不高于24%，5個中蜂蜜水分含量均達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且 11-2#、11-3#、11-4#、11-5# 已達(dá)到優(yōu)級蜜標(biāo)準(zhǔn)；酸度一般是指中和每100 g試樣所需1 mol/L氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)，SN/T 0852-2012《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定蜂蜜的酸度值不得大于40 mL/kg（1 mol/L氫氧化鈉）。試驗(yàn)測得5個中蜂蜜的酸度值在23.55 mL/kg～32.56 mL/kg之間，達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，其中11-1#酸度值最高，明顯高于相鄰地區(qū)產(chǎn)的11-3#和11-4#蜂蜜樣品。說明蜂蜜酸度值與所產(chǎn)地域有關(guān)，證實(shí)蜜源植物對酸度值影響較大[16]，除此之外，酸度還與地理環(huán)境、采樣過程和儲存條件有關(guān)[17]。糖類物質(zhì)是蜂蜜的主要成分[18]，果糖是影響蜂蜜甜味的糖，而葡萄糖含量則取決于花蜜的來源[19]。5個中蜂蜜的還原糖（葡萄糖和果糖）含量均超過60%，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。純天然蜂蜜中蔗糖含量低是由于蔗糖在蜂蜜中轉(zhuǎn)化酶的作用下被分解[20]。5個中蜂蜜均未檢測出蔗糖。蜂蜜中有很多活性酶，淀粉酶的穩(wěn)定性較差，研究表明，蜂蜜的是否摻假、是否經(jīng)過熱處理都可以參照淀粉酶值[21]。5個中蜂蜜的淀粉酶值在10.40 mL/（g·h）～16.59 mL/（g·h）之間，均達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（≥4[mL/（g·h）]）。蜂蜜樣品中羥甲基糠醛的測定反映了樣品的新鮮度，國標(biāo)中規(guī)定羥甲基糠醛不應(yīng)超過40 mg/kg，羥甲基糠醛水平的升高與蜂蜜樣品在高溫或過熱條件下貯藏時間的延長有關(guān)[22-23]。5個中蜂蜜樣品的羥甲基糠醛值均遠(yuǎn)低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（40 mg/kg）。

2.2 抗氧化指標(biāo)含量分析

5個中蜂蜜樣品中總黃酮、總酚酸含量檢測結(jié)果分析如表2所示。

表2 5種中蜂蜜樣品中總酚酸、總黃酮含量Table 2 Total contents of phenolic and flavonoid compounds of five Apis cerana honeys

多酚類抗氧化劑對自由基有很強(qiáng)的清除作用，可以通過轉(zhuǎn)移氫原子或電子并形成苯氧自由基陽離子來阻斷自由基導(dǎo)致的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而起到抗氧化的作用，而多酚類化合物主要來源于蜜源植物[24]。這些化合物不僅是蜂蜜中起抗氧化活性的重要物質(zhì)，而且能夠確定蜂蜜的植物源和地理來源[25]，也是評價蜂蜜真?zhèn)蔚闹匾笜?biāo)性化合物[26]。5個中蜂蜜總黃酮含量檢測范圍為9.95 mg/100 g～13.66 mg/100 g，其中11-1#的總黃酮含量最高，達(dá)（13.66±0.04）mg/100 g。此外，不同中蜂蜜的的總酚酸含量存在明顯差異，11-2#中總酚酸含量最高達(dá)31.71 mg/100 g，總酚酸含量最低的是11-3#，其含量為20.69 mg/100 g，明顯低于11-1#和11-4#樣品的總酚酸含量。神農(nóng)架林區(qū)5個不同區(qū)域的中蜂蜜含有豐富的多酚類化合物，但其總黃酮、總酚酸含量具有差異性，這與中蜂采集的蜜源植物有著很大的關(guān)系，也與局部地域土壤成分有關(guān)[27]。

2.3 自由基清除能力

DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力是兩種評估蜂蜜體外抗氧化水平的方法，且這兩種方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好。DPPH·是一種合成的、穩(wěn)定的、具有單電子的有機(jī)自由基。DPPH自由基有機(jī)溶液呈現(xiàn)紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當(dāng)加入抗氧化劑時，DPPH·與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)后，溶液從深紫色變?yōu)辄S色，在517 nm處的吸收值降低，其變化程度與自由基清除作用呈線性關(guān)系，通過線性變化計(jì)算自由基清除率，通常用IC50值來表示，即當(dāng)對DPPH·抑制率達(dá)到50%時，所需抗氧化劑的量，因此IC50值越小，說明對DPPH·清除作用就越強(qiáng)[28-29]。5種中蜂蜜抗氧化能力見表3。

表3 5種中蜂蜜抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of five Apis cerana honeys

通過表3可知，5個不同區(qū)域的中蜂蜜對DPPH自由基和ABTS+自由基都有不同程度的清除作用。IC50值越小，說明蜂蜜對自由基的清除能力越強(qiáng)。表3為5個中蜂蜜IC50值的比較，11-3#清除DPPH自由基能力遠(yuǎn)小于其他4種蜂蜜，IC50值為106.63 mg/mL。11-4#的IC50值為39.14 mg/mL，表明其具有較好的清除自由基能力，5種蜂蜜對ABTS+自由基清除能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋?1-2#＞11-4#＞11-1#＞11-5#＞11-3#，其中11-3#對ABTS+自由基清除能力最弱，IC50值最高達(dá)127.07 mg/mL?？偟膩碚f，11-2#和11-4#的清除自由基能力最強(qiáng)，抗氧化性最好。

2.4 蜂蜜抗氧化物質(zhì)及清除自由基能力之間的相關(guān)性分析

5個不同中蜂蜜抗氧化物質(zhì)與清除自由基能力之間相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

表4 中蜂蜜抗氧化物質(zhì)與抗氧化活性相關(guān)性Table 4 Correlations of antioxidant substance and antioxidant activities of Apis cerana honey

由表4可知蜂蜜的總酚酸含量與清除DPPH自由基能力相關(guān)性極顯著（r=0.973），說明總酚酸含量越高，蜂蜜清除DPPH自由基能力就越強(qiáng)。蜂蜜的總酚酸含量與清除ABTS+自由基能力值相關(guān)性顯著（r=0.920），說明總酚酸含量越高，清除ABTS+自由基的活性越高。DPPH與ABTS自由基清除能力呈顯著的正相關(guān)（r=0.881）。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)神農(nóng)架林區(qū)中蜂蜜理化指標(biāo)符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，其總黃酮、總酚酸含量在不同的區(qū)域存在著顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果也顯示蜂蜜中含有的總酚酸含量越高，蜂蜜的抗氧化能力也越強(qiáng)。而蜂蜜中酚類物質(zhì)來于蜜源植物，因此，雖同樣采集于神農(nóng)架林區(qū)，也會因蜜源植物分布的差異，而導(dǎo)致蜂蜜抗氧化能力的差異，這與前人文獻(xiàn)報道一致。神農(nóng)架林區(qū)中蜂蜜其他指標(biāo)及成分還需進(jìn)一步研究，為當(dāng)?shù)胤洚a(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。