核酸適配體技術(shù)在畜產(chǎn)品獸殘檢測(cè)中的應(yīng)用

謝希楊，孫萬(wàn)成，羅毅皓

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

畜產(chǎn)品，如肉類(lèi)、牛奶和雞蛋等，是日常飲食的重要組成部分，由于它們是非常好的磷和蛋白質(zhì)的來(lái)源，所以它們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)的消費(fèi)量正在迅速增加。同時(shí)，我國(guó)每年都有大量畜禽牲畜死于寄生蟲(chóng)病或因病導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻，嚴(yán)重影響了相關(guān)畜產(chǎn)品的質(zhì)量。在養(yǎng)殖牲畜時(shí)使用激素類(lèi)、抗生素類(lèi)和驅(qū)蟲(chóng)抗蟲(chóng)類(lèi)獸藥，已成為難以避免的環(huán)節(jié)。正確合理地使用獸藥可以促進(jìn)牲畜健康成長(zhǎng)，提高畜產(chǎn)品整體質(zhì)量。與此同時(shí)，對(duì)畜產(chǎn)品中的獸殘進(jìn)行檢測(cè)是至關(guān)重要的。核酸適配體有“化學(xué)抗體”一稱(chēng)，是由指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出的一段寡核苷酸片段，可以識(shí)別并與靶分子特異性結(jié)合，作為一種分子識(shí)別元件，與傳統(tǒng)抗體相比具有靶分子廣、特異性高、親和性高、靈敏度高的特點(diǎn)，在檢測(cè)方面有廣闊的前景。該文圍繞畜產(chǎn)品，在獸殘傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，綜述核酸適配體在各類(lèi)獸殘檢測(cè)中的應(yīng)用，以期為獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的深入研究提供理論參考。

1 獸藥概述

1.1 畜產(chǎn)品中獸藥殘留的污染

畜產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品中至關(guān)重要的組成部分，通常指動(dòng)物產(chǎn)品或其二次加工產(chǎn)品，本文主要圍繞可食用畜產(chǎn)品展開(kāi)概述。獸藥是指用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能的物質(zhì)。牲畜接觸藥物的途徑有經(jīng)皮膚、經(jīng)消化道、經(jīng)靜脈注射3種，藥物進(jìn)入機(jī)體后會(huì)因蓄積作用而殘留在體內(nèi)，對(duì)畜產(chǎn)品造成污染。污染程度受接觸劑量、接觸方式、給藥時(shí)間、個(gè)體差異等因素的影響。因毒性大、療效不確定、質(zhì)量不穩(wěn)定、不夠環(huán)保等原因，已有大量獸藥被禁用。同時(shí)，飼料在生產(chǎn)、加工、貯運(yùn)過(guò)程中也有可能受到重金屬、除草劑、霉菌毒素的污染，這些物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后同樣會(huì)因蓄積作用而殘留在體內(nèi)，進(jìn)而污染畜產(chǎn)品。

1.2 獸殘的毒性作用

消費(fèi)者誤食受污染畜產(chǎn)品會(huì)對(duì)健康造成不利影響，例如，長(zhǎng)期攝入磺胺類(lèi)藥物會(huì)引起腎損害，氨基糖苷類(lèi)抗生素具有耳、腎毒性，誤食氯霉素則會(huì)造成再生障礙性貧血，經(jīng)常食用含有青霉素、四環(huán)素等抗菌性藥物殘留的食品會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)等。而β-受體激動(dòng)劑、β-受體阻斷劑、鎮(zhèn)靜劑、血管擴(kuò)張劑等藥物具有急性毒性，消費(fèi)者誤食后會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成嚴(yán)重威脅。鑒于獸殘的毒性和副作用，各國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)不同畜產(chǎn)品中的獸藥規(guī)定了最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）。例如，歐盟在牛奶、肌肉和肝臟中建立的鏈霉素（streptomycin，STR）MRL 為 500 ng/g[1]。

1.3 傳統(tǒng)獸殘檢測(cè)方法的應(yīng)用

獸藥殘留的檢測(cè)技術(shù)起步較早，涉及色譜、質(zhì)譜、光譜、微生物學(xué)、免疫學(xué)等多個(gè)方面，已建立的檢測(cè)技術(shù)包括高效液相色譜、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用、液相-質(zhì)譜聯(lián)用、生物發(fā)光-細(xì)菌分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。這些方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但也存在樣品預(yù)處理復(fù)雜、儀器價(jià)格昂貴等問(wèn)題。

1.3.1 電泳技術(shù)

2008年，高楊菲等[2]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）成功地從肉制品中檢測(cè)出克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺等β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，檢出限為0.2 μg/mL。孟歡歡等[3]也從牛奶中檢測(cè)出氨芐青霉素、阿莫西林，檢出限分別為 0.12 μg/mL 和 0.23 μg/mL。此外，2012 年，鄧光輝等[4]采用膠束電泳體系從豬肉樣品中檢測(cè)出了3種β-受體激動(dòng)劑，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，該方法重現(xiàn)度、精確度良好。電泳技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用，在獸殘檢測(cè)方面也有較廣泛的應(yīng)用。Moreno-González等[5]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳與四極飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定了牛奶樣品中15種抗生素殘留量（8種四環(huán)素和7種喹諾酮類(lèi)），重復(fù)性良好。

1.3.2 免疫學(xué)方法

獸藥殘留免疫分析方法的建立包括待測(cè)物選擇、半抗原及人工抗原的合成、抗體制備及測(cè)定方法建立等步驟。Kabrite等[6]采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了黎巴嫩當(dāng)?shù)嘏Ｄ讨兴沫h(huán)素和青霉素的殘留量，兩項(xiàng)指標(biāo)的平均值均低于酶聯(lián)免疫試劑盒的檢出限，最高標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為 1.80 μg/kg 和 4.00 μg/kg。Baghani等[7]利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)分別對(duì)伊朗當(dāng)?shù)仉u肉和牛肉樣品中的四環(huán)素和環(huán)丙沙星進(jìn)行了檢測(cè)，檢出的環(huán)丙沙星所占百分比除一份樣品外，均低于MRL，檢出四環(huán)素含量極低。徐蓓等[8]將新霉素連接辣根過(guò)氧化物酶作為酶標(biāo)抗原，建立了新霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，確立了抗體最佳工作濃度，為免疫學(xué)在獸殘檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1.3.3 色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1960年～1969年，氣相色譜的出現(xiàn)解決了先前化學(xué)分析檢測(cè)中許多痕量物質(zhì)難以檢測(cè)分析的問(wèn)題，檢測(cè)限一般為μg/kg級(jí)。但由于大多數(shù)獸藥沸點(diǎn)偏高，很大程度上限制了氣相色譜的應(yīng)用。1970年之后，液相色譜和高效液相色譜的相繼出現(xiàn)大大擴(kuò)展了色譜法在獸殘分析檢測(cè)中的應(yīng)用。張恒等[9]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)畜產(chǎn)品中的兩種β激動(dòng)劑進(jìn)行了研究，建立了一種高效、快速、高回收率的檢測(cè)方法。孫姝琦等[10]通過(guò)應(yīng)用超高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，同時(shí)分析牛肉中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星3種氟哇諾酮類(lèi)獸藥，回收率良好，檢出限分別為5.0、2.0、5.0 μg/kg。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也是 GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中規(guī)定檢測(cè)畜產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.3.4 微生物學(xué)方法

早在1963年，Kavangh等就以表皮葡萄球菌作為測(cè)試菌株測(cè)定了血清和組織中的新霉素含量，靈敏度分別為 0.02 μg/mL 和 0.5 μg/mL。1970 年，Neff等[11]報(bào)道了一套測(cè)定飼料中新霉素含量的微生物學(xué)方法，以表皮葡萄菌作為測(cè)試菌，平均回收率達(dá)95.5%。隨后，該方法被美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）認(rèn)定為測(cè)定飼料中新霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法。2004年，溫芳等[12]以支氣管炎博代特氏菌作為檢測(cè)菌株，建立了一種靈敏快捷便于使用的硫酸粘桿菌素殘留檢測(cè)微生物學(xué)方法，在肌肉組織、肝臟和腎臟組織中的檢出限分別為0.15、0.20、0.20 μg/g，低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部和歐盟規(guī)定的最高殘留限量。

1.3.5 光譜法

秦堅(jiān)源等[13]以畜產(chǎn)品藥物殘留中常見(jiàn)的4種四環(huán)素類(lèi)抗生素作為檢測(cè)對(duì)象，應(yīng)用太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)，建立四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法和定量分析模型，為獸殘檢測(cè)開(kāi)辟了新的思路。2018年，Concei??o等[14]利用傅里葉變換近紅外光譜法（Fourier transform near infrared spectroscopy，F(xiàn)TNIR）成功檢測(cè)了牛奶中的抗菌藥物殘留，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法快速檢測(cè)了注射藥物的奶牛牛奶中鹽酸頭孢噻福爾的含量，除了追蹤檢測(cè)，還能跟蹤動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程。

1.4 新型獸殘檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

1.4.1 納米材料生物傳感器在獸殘檢測(cè)中的應(yīng)用

Ramezani等[15]利用三螺旋分子開(kāi)關(guān)（triple helix molecular switch，THMs）和金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）制備了快速、選擇性、靈敏的四環(huán)素比色測(cè)定儀，根據(jù)AuNPs的不同顏色，可進(jìn)行四環(huán)素的測(cè)定，最低檢出限為266 pmol/L。此外，該傳感器還能較好地檢測(cè)血清和牛奶中的四環(huán)素。

在檢測(cè)生長(zhǎng)促進(jìn)劑方面，Li等[16]提出了一種檢測(cè)17β-雌二醇的分子印跡電化學(xué)傳感器。在最佳條件下，該傳感器具有較低的檢出限（0.819 nmol/L）和較寬的線性范圍（0.05 μmol/L～10 μmol/L）。

在檢測(cè)抗寄生蟲(chóng)藥時(shí)，Radi等[17]用循環(huán)伏安法在一次性絲網(wǎng)印刷碳電極上制備了聚吡咯膜，并制備了電化學(xué)傳感器，可用來(lái)測(cè)定氟哌啶醇的含量。

在檢測(cè)非甾體類(lèi)抗炎藥時(shí)，Kianoush等[18]采用多壁碳納米管和離子液體修飾碳陶瓷電極，建立了能同時(shí)檢測(cè)雙氯芬酸（diclofenac，DFC）和吲哚美辛（indomethacin，IND）的傳感器，DCF和IND測(cè)定的線性范圍分別為 0.05 μ/L～50 μ/L 和 1 μ/L～50 μ/L。

1.4.2 量子點(diǎn)在獸殘檢測(cè)中的應(yīng)用

量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是由無(wú)機(jī)核和有機(jī)分子組成的納米晶，表面包覆在核表面，尺寸在1 nm到10 nm之間。在獸藥殘留檢測(cè)中，量子點(diǎn)通常用作光源和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑。與量子點(diǎn)結(jié)合的材料包括抗體、酶、適配體（aptamer，APT）和分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）等。

Chen等[19]首次報(bào)道了間接競(jìng)爭(zhēng)量子點(diǎn)熒光免疫分 析 法 （quantum dot fluorescent immunoassay，QDFLISA）法測(cè)定雞體內(nèi)恩諾沙星殘留量。雞體內(nèi)恩諾沙星濃度越高，微板熒光強(qiáng)度越低，檢出限為2.5 μg/L。

QD抗體生物傳感器由電化學(xué)電極和固定在電極表面的量子點(diǎn)與抗體結(jié)合組成，而量子點(diǎn)和抗體通過(guò)活化酯或吸附法結(jié)合。Zhang等[20]建立了用該傳感器快速、靈敏地檢測(cè)沙丁胺醇（salbutamol，SAL）的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法（enhanced chemiluminescence，ECL），靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，適用于豬肉和肝臟樣品的檢測(cè)。

2 核酸適配體研究概況

2.1 核酸適配體簡(jiǎn)介

Tuerk等[21]于1990年首次提出并使用SELEX技術(shù)，他們從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中成功篩選出了可與噬菌體T4DNA聚合酶（gp43）特異性結(jié)合的RNA寡核苷酸。同年，Ellington等[22]將這種篩選得到的寡核苷酸命名為aptamer，即核酸適配體，又被稱(chēng)為適配體、適體等。核酸適配體是經(jīng)SELEX技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選出的單鏈寡聚核苷酸片段，即一段長(zhǎng)度為20 nt～60 nt的DNA或RNA序列。篩選得到的適配體序列具有豐富的堿基組合和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，可利用不同的空間結(jié)構(gòu)和折疊模式特異性結(jié)合靶物質(zhì)，是高特異性功能識(shí)別原件[23]，具有靈敏度高、靶物質(zhì)廣、親和力強(qiáng)、易改造、易制備、運(yùn)輸儲(chǔ)存成本低等優(yōu)點(diǎn)。靶物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)或者其它小分子物質(zhì)，已研究報(bào)道的有細(xì)胞、病毒、金屬離子等。

2.2 核酸適配體作用原理

當(dāng)適配體與靶物質(zhì)共存時(shí)，靶物質(zhì)能夠誘導(dǎo)適配體由自由構(gòu)象折疊成假結(jié)、發(fā)卡、G-四分體、凸環(huán)等三維空間結(jié)構(gòu)，并通過(guò)堿基對(duì)的堆積作用、靜電作用、氫鍵作用等與靶物質(zhì)特異性結(jié)合[23]。

核酸適配體技術(shù)的核心在于如何獲得高親和性單一適配體序列。SELEX技術(shù)是目前最常用的適配體篩選手段。通常是將靶物質(zhì)與一個(gè)1012～1014庫(kù)容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行孵育，直至充分結(jié)合。然后利用親和層析法、硝酸纖維素膜過(guò)濾法、高速離心法或磁珠分離法洗脫掉沒(méi)結(jié)合的核苷酸序列，再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體外擴(kuò)增技術(shù)對(duì)結(jié)合靶物質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)8～20輪的篩選和擴(kuò)增，即可能得到與靶物質(zhì)特異性結(jié)合且高親和力的適配體[24]。

適配體能被熒光標(biāo)記物、氨基、磷酸基等活性基團(tuán)修飾而被開(kāi)發(fā)成生物傳感器，用于檢測(cè)各種靶物質(zhì)。

3 適配體技術(shù)在獸殘檢測(cè)方面的應(yīng)用

3.1 獸藥適配體的篩選

目前為止，傳統(tǒng)獸殘檢測(cè)方法往往存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、場(chǎng)地要求高、設(shè)備昂貴、流程繁瑣等問(wèn)題，相對(duì)而言，核酸適配體技術(shù)具有檢測(cè)周期短、場(chǎng)所不受限、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)勢(shì)。雖然核酸適配體技術(shù)起步較晚，仍在不斷地探索和研究當(dāng)中，但已經(jīng)有很多科研工作者篩選出了可用于檢測(cè)獸藥殘留的適配體序列見(jiàn)表1。其中，解離常數(shù)越小，代表適配體與靶物質(zhì)的親和力越大。

表1 獸藥殘留適配體序列Table 1 Veterinary drug residue aptamer sequence

3.2 抗生素殘留

卡那霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，用于治療沙門(mén)氏菌感染、肺結(jié)核等，過(guò)量攝入機(jī)體會(huì)產(chǎn)生耳毒性或腎毒性。常見(jiàn)的氨基糖苷類(lèi)抗生素有卡那霉素、鏈霉素、新霉素等。廖且根等[32]以卡那霉素適配體修飾納米銀粒子作為探針，用共振光散射技術(shù)檢測(cè)雞肉樣品中的卡那霉素，檢測(cè)線為1.0 μg/kg。馮榮榮等[33]分別利用納米金（gold nanoparticles，GNPs）/石墨烯（graphene，GR）復(fù)合納米材料和巰基自組裝作用針對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素研制了兩種電化學(xué)傳感器，成功檢出了卡那霉素和鏈霉素，檢出限分別為0.03、0.3 pmol/L。Alvarez等[30]通過(guò)將適配體與電極表面新霉素B相互作用固定，檢出了牛奶中25 mmol/L～2 500 mmol/L的新霉素B。

四環(huán)素是四環(huán)素族抗生素中的一種，因價(jià)格低、抗菌性好而被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖，導(dǎo)致其在可食用畜產(chǎn)品中殘留普遍，給環(huán)境帶來(lái)了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。許景月等[34]以核酸適配體作為識(shí)別元件、以插入型染料噻唑橙作為信號(hào)元件構(gòu)建了一種非標(biāo)記核酸適配體傳感器，根據(jù)噻唑橙的熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行判斷識(shí)別，對(duì)四環(huán)素進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.022 μg/mL。王賽等[35]針對(duì)蜂蜜中的四環(huán)素，分別創(chuàng)建了酶聯(lián)核酸適配體生物傳感器、納米金-核酸適配體生物傳感器、表面等離子共振-核酸適配體生物傳感器、電化學(xué)核酸適配體生物傳感器等4種用于快速檢測(cè)的生物傳感器，加標(biāo)回收率均在85%～120%之間，有較高的準(zhǔn)確性。羅葉麗[31]利用巰基乙胺修飾納米金粒子，根據(jù)粒子溶液的顏色和色譜，檢測(cè)牛奶中的四環(huán)素，檢出限為0.039 μg/mL。

在QD-APT傳感器中，APT通過(guò)活化酯、吸附或雜交方法與QD（或AuNPs）結(jié)合。用于農(nóng)藥和獸藥殘留檢測(cè)的QD-APT傳感器的信號(hào)類(lèi)型主要有：熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光猝滅、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法、光電化學(xué)分析法等。Alibolandi等[36]用活化酯法將巰基乙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)與氯霉素APT的氨基端結(jié)合，制備氯霉素的APT-QD。然后，在APT-QD溶液中加入氧化石墨烯（graphite oxide，GO），APT-QD 與 Go的 Sp2雜化軌道之間通過(guò)π-π鍵結(jié)合。當(dāng)Go/APT-QD溶液中的量子點(diǎn)被激發(fā)時(shí)，在由QD和GO組成的FRET體系中，激發(fā)能被氧化石墨烯吸收，在630 nm處量子點(diǎn)的熒光將被猝滅。當(dāng)樣品加入該溶液時(shí)，氯霉素將與APT結(jié)合，與氯霉素結(jié)合的APT也會(huì)從石墨烯上脫落。由于熒光共振能量體系的解體，量子點(diǎn)的熒光將恢復(fù)。在0.1 nm～10 nm范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與氯霉素濃度成正比，檢出限為 9.8×10-11mol/L。

除了對(duì)單一抗生素的檢測(cè)方法的研究，許多科研人員研發(fā)出了可以檢測(cè)多種抗生素的檢測(cè)器。喬立新等[37]利用海藻酸鈉-淀粉凝膠將瑞士乳酸菌固定到兩片核微孔膜中間制成傳感膜，并將其固定于到玻碳電極上制成生物傳感電極，分別對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限分別為 1×10－10、1×10－9、1×10－9g/mL，檢出時(shí)間為4 min，明顯優(yōu)于國(guó)內(nèi)外對(duì)抗生素殘留量的要求。周靈櫻等[38]在微芯片電泳檢測(cè)分離技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了一種高通量、無(wú)標(biāo)記的適體傳感器，可用于不同食品中氯霉素的檢測(cè)，具有良好的回收率。隨后，又開(kāi)發(fā)了一種可同時(shí)檢測(cè)卡那霉素和氯霉素的適體傳感器，檢出限分別為0.002 5、0.006 0 nmol/L，該方法檢測(cè)快速，可在1 h內(nèi)檢測(cè)48個(gè)樣品，在抗生素檢測(cè)方面有很好的應(yīng)用前景。

3.3 激素殘留

殘留在食品中的激素多以性激素為主，有雌激素和雄激素，常見(jiàn)的雌激素有雌二醇等。付田等[39]以雌二醇核酸適配體的長(zhǎng)度作為變量，以膠體金的顏色變化作為判斷依據(jù)，構(gòu)建了一種基于核酸適配體序列的超靈敏比色法，對(duì)雌二醇的檢出限為2.7 pg/mL，可用于牛奶中雌二醇的檢測(cè)。17β-雌二醇是雌二醇反式構(gòu)型，是一種重要的環(huán)境雌激素，進(jìn)入人體后會(huì)干擾體內(nèi)原有激素作用，于笑沨等[40]利用檸檬酸鈉和氯金酸制備出檸檬酸根包被的負(fù)電金納米粒子，通過(guò)監(jiān)測(cè)識(shí)別金納米粒子的聚散狀態(tài)、相應(yīng)的紫外吸收光譜的變化以及體系顏色的改變，建立了一種可用于快速檢測(cè)17β-雌二醇的方法，檢出限為3 ng/mL，該方法成本低廉、方便快捷，為小分子現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持。

19-去甲基睪酮是一種雄激素，白文薈等[41]在研究適配體長(zhǎng)度對(duì)適配體納米金比色法靈敏度影響時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)原長(zhǎng)度76個(gè)堿基的17β-雌二醇適配體在片段化后對(duì)19-去甲基睪酮具有很強(qiáng)的親和性，在此基礎(chǔ)上，他們建立了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的夾心熒光檢測(cè)法，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)19-去甲基睪酮的有效檢測(cè)，有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3.4 合成抑菌劑

抑菌劑可分為磺胺類(lèi)和氟奎諾酮類(lèi)，恩諾沙星是一種奎諾酮類(lèi)抑菌劑，磺胺二甲嘧啶則是磺胺類(lèi)抑菌劑的一種，長(zhǎng)期攝入此類(lèi)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。倪姮佳等[42]以恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶為靶分子，首次篩選出能特異性識(shí)別這兩種抗菌藥的核酸適配體，相應(yīng)建立了直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光分析方法，檢出限分別為2.26 ng/mL和0.92 ng/mL。建立針對(duì)磺胺二甲嘧啶的核酸適配體生物傳感器也是近幾年的熱點(diǎn)。杜家音等[43]利用液晶（liquid crystals，LCs）這種具有優(yōu)異理化特性的軟物質(zhì)材料，開(kāi)發(fā)了一種基于三乙氧基丁醛硅烷/N，N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基三甲氧基氯化物混合自組裝膜的液晶型生物傳感器并用于磺胺二甲氧嘧啶的檢測(cè)，該方法對(duì)磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè)下限可低至10 μg/L，并具有非常好的選擇性。他們還在之前研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了核酸適配體同時(shí)作為液晶的垂直取向分子和磺胺二甲氧嘧啶識(shí)別分子的液晶型生物傳感器，該方法檢測(cè)磺胺二甲氧嘧啶的濃度可進(jìn)一步下降至 0.9 μg/L。

3.5 β-腎上腺受體激動(dòng)劑

β-腎上腺受體激動(dòng)劑是一類(lèi)具有腎上腺素功能的苯乙醇胺類(lèi)人工合成化合物，因其促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)再分配等功效，常被用于非法養(yǎng)殖。萊克多巴胺是一種人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑，有增長(zhǎng)肌肉、減少脂肪蓄積的功效，是一種新型瘦肉精。許景月等[34]在核酸適配體與目標(biāo)物的特異性結(jié)合以及羅丹明B和金納米粒子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上，建立了一種檢測(cè)萊克多巴胺的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器，已成功應(yīng)用于雞肝中萊克多巴胺殘留的測(cè)定。羅葉麗[31]利用檸檬酸根修飾納米金粒子，檢測(cè)豬尿樣中的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺，檢出限分別為0.015 8 μg/mL和0.029 9 μg/mL。

Lin等[44]通過(guò)在石墨烯全氟磺酸修飾的玻碳電極上電聚合酸鉻藍(lán)K，研制了一種可檢測(cè)8種不同β-激動(dòng)劑的電化學(xué)傳感器，檢測(cè)限為0.58 ng/mL～1.6 ng/mL。Wang等[45]通過(guò)用納米銀鈀合金抗體修飾適配體，建立了一種電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)萊克多巴胺、克倫特羅和沙丁胺醇，檢測(cè)限分別為1.52、1.44、1.38 pg/mL。楊敏等[46]通過(guò)等溫滴定量熱技術(shù)篩選出一條可特異性結(jié)合β-激動(dòng)劑的單鏈DNA，相應(yīng)地建立了一個(gè)電化學(xué)核酸適配體生物傳感器，可檢測(cè)萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、苯乙醇胺和丙卡特羅等多種 β-激動(dòng)劑，檢測(cè)限分別為 0.04、0.35、0.53、1.0、1.73 pg/mL。

3.6 真菌毒素

赭曲霉素A（ochratoxin A，OTA）是一類(lèi)分布較廣的真菌毒素，主要由曲霉菌屬和青霉菌屬代謝生成。OTA可以直接污染谷類(lèi)，極易被動(dòng)物間接攝入體內(nèi)，并因蓄積作用進(jìn)一步殘留在動(dòng)物體內(nèi)，最終作為畜產(chǎn)品影響人類(lèi)的健康。根據(jù)現(xiàn)有研究可知，OTA對(duì)腎臟、肝臟和免疫毒性有較強(qiáng)的毒性。2017年，陳丹等[47]基于納米銀與碳量子點(diǎn)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，設(shè)計(jì)了一種快速檢測(cè)OTA的方法。該研究分別對(duì)納米銀和碳量子點(diǎn)進(jìn)行功能化修飾，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，縮短兩者距離，以便于熒光能量共振的發(fā)生，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。加入目標(biāo)物OTA后，由于OTA與納米銀上修飾物之間的特異性結(jié)合，使納米銀和碳量子點(diǎn)的距離增大，從而使碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度恢復(fù)，以此定量檢測(cè)OTA。在實(shí)驗(yàn)最佳條件下，OTA最低檢出限為 8.7 nmol/L，線性范圍為 0～5 000 nmol/L。2019年，張立轉(zhuǎn)等[48]構(gòu)建了一種基于聚多巴胺納米顆粒（polydopamine nanospheres，PDANPs）的熒光生物傳感器，標(biāo)記有熒光團(tuán)的核酸適配體可通過(guò)π-π堆積作用吸附于PDANPs表面，使適配體上熒光團(tuán)的熒光猝滅。加入OTA后，OTA與核酸適配體特異性結(jié)合，使核酸適配體從單鏈狀態(tài)折疊為穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。由于G-四鏈體與PDANPs之間的結(jié)合能力弱，導(dǎo)致傳感體系的熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)了OTA的定量測(cè)定，檢出限為20 nmol/L。

4 總結(jié)

整體而言，核酸適配體技術(shù)在畜產(chǎn)品獸殘檢測(cè)方面的應(yīng)用仍處于起步階段，各類(lèi)獸殘的研究發(fā)展不夠平衡，現(xiàn)有研究多以抗生素、β-腎上腺受體激動(dòng)劑等成分的檢測(cè)和傳感器研發(fā)為主，而少有在激素、驅(qū)蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，大多數(shù)獸殘成分的檢測(cè)依舊以高效液相色譜等主流方式為主。根據(jù)查閱的文獻(xiàn)可以了解到，獸殘檢測(cè)對(duì)象主要是牛肉、豬肉、雞肉等畜產(chǎn)品，在羊肉中的應(yīng)用幾乎為空白。核酸適配體在檢測(cè)方面具有很明顯的優(yōu)勢(shì)，但目前為止，包括獸殘檢測(cè)在內(nèi)，核酸適配體及其生物傳感器現(xiàn)有的應(yīng)用多針對(duì)食品中的有害成分，包括霉菌毒素、重金屬、農(nóng)藥殘留等，少有在有益成分或者常規(guī)成分檢測(cè)中的應(yīng)用。核酸適配體技術(shù)作為一種新型檢測(cè)方式，具有相當(dāng)廣闊的發(fā)展前景，相信在不久的未來(lái)，在廣大科研工作者的共同努力下，這項(xiàng)技術(shù)能夠更加普及，更加實(shí)用。