超聲提取及HPLC測定蒲公英中綠原酸

冀新花 劉艷芳

摘 要：采用高效液相色譜（HPLC）法測定蒲公英中的綠原酸含量，通過正交試驗優(yōu)化蒲公英超聲提取的工藝條件。結(jié)果表明：超聲提取優(yōu)化工藝條件為甲醇濃度60%，提取時間40min，提取溫度28℃。在優(yōu)化條件下，采用HPLC法測定焦作地區(qū)4個蒲公英樣品，其綠原酸含量在0.268～0.281mg/g。因此，超聲提取是一種HPLC分析綠原酸含量的適宜前處理方法。

關(guān)鍵詞：蒲公英;綠原酸;提取;檢測

中圖分類號 TQ461文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0036-03

Abstract： To determine of chlorogenic acid in dandelion by HPLC， the ultrasonic extraction conditions were optimal by orthogonal test. The results shown that optimum extraction conditions are as follows： methanol concentration 60%，time 40min，temperature 28℃. Under the optimum extraction conditions. Content of chlorogenic acid for four samples from Jiaozhu city were The content of chlorogenic acid of four dandelion samples from Jiaozhu were determined by HPLC. The content of chlorogenic acid from samples were0.268-0.281mg/g. So ultrasonic? extraction was a suitable pre-treatment method for determine chlorogenic acid in dandelion.

Key words： Dandelion; Chlorogenic acid; Ultrasonic extraction; Determine

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.），為菊科蒲公英屬多年生草本植物[1-2]，具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等作用。蒲公英的主要活性成分有綠原酸、咖啡酸、黃酮、多糖、甾醇、萜類化合物等[6-7]，其中綠原酸具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等功能作用[8-9]，是蒲公英中重要的活性成分。為了有效地分析蒲公英中綠原酸，需要對其進行有效提取，目前常用的提取方法為熱回流法和溶劑浸提法[10]，但提取時間均較長。為了快速準確分析蒲公英中綠原酸，本研究采用超聲強化提取、HPLC法分析蒲公英中綠原酸，為蒲公英的加工利用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 蒲公英采自河南省焦作市武陟縣，實驗室烘干，粉碎后備用;綠原酸對照品（純度≥99%）：成都曼思特生物科技有限公司;甲醇（色譜純）、乙酸（優(yōu)級純）、乙腈（色譜純）：國藥集團;240W PS-40A型數(shù)控超聲波清洗器，深圳市康潔洗凈電器有限公司;安捷倫1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 采用Agilent ZoRBAX SB-C18色譜柱（250×4.6mm 5μm），流動相以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）為流動相，流速1.0mL/min;柱溫30℃;波長326nm，進樣量10μL。

1.2.2 綠原酸標準曲線的繪制 采用甲醇準確配制成質(zhì)量濃度分別為0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL的標準溶液，在326nm下HPLC測定峰面積。

1.2.3 超聲提取蒲公英中綠原酸的條件選擇 稱取一定量粉碎的蒲公英，依次選擇不同甲醇溶液（20%、40%、60%、80%和100%）、不同提取時間（10、20、30、40、50min）及不同提取溫度（20、25、30、35、40℃），在超聲提取裝置中提取，提取后合并濾液，濾紙過濾后采用微濾膜過濾，定容后采用HPLC法測定綠原酸含量。

1.2.4 正交試驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以得率為指標，以甲醇濃度（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）為因素，采用L9（3）4正交試驗進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標準曲線的繪制 根據(jù)1.2.1的條件，以綠原酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，其結(jié)果見圖1。由圖1可知，曲線方程為[Y=35.196X+0.2951（R2=0.9994）]。

2.2 甲醇溶液濃度對綠原酸得率的影響 依次選擇不同甲醇溶液（20%、40%、60%、80%和100%）、提取時間40min，提取溫度（30℃），測定不同甲醇溶液濃度對綠原酸得率的影響，其結(jié)果見圖2。由圖2可知，在甲醇濃度60%以前，隨著濃度的增加，綠原酸的提取得率增加，濃度大于60%以后，繼續(xù)增加濃度，得率反而下降。這是由于60%甲醇的極性大小和綠原酸極性相似，按相似相溶原理，60%甲醇濃度是提取適宜的濃度。

2.3 提取時間對綠原酸得率的影響 采用60%甲醇溶液，提取時間（10、20、30、40、50min），提取溫度（30℃），測定不同提取時間對綠原酸得率的影響，其結(jié)果見圖3。由圖3可知，在提取時間40min以前，隨著時間的增加，綠原酸提取得率增加，但提取時間40min以后，繼續(xù)增加時間，得率增加較小，這是由于40min已經(jīng)將綠原酸充分提取。因此，40min是適宜的提取時間。

2.4 提取溫度對綠原酸得率的影響 采用60%甲醇溶液，提取時間40min，測定不同提取溫度對綠原酸得率的影響，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，30℃以前，隨著溫度的增加，綠原酸提取得率增加，但30℃以后，繼續(xù)增加溫度，得率減少，這是由于高溫對綠原酸有破壞。因此，適宜的提取溫度為30℃。

2.5 提取工藝條件的優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9（3）4正交試驗表，就甲醇濃度、超聲時間、超聲溫度時對得率的影響進行了正交試驗。因素水平表見表1，試驗結(jié)果見表2。由表2的R值可見，各因素影響的順序從大到小依次為甲醇濃度>時間>溫度。提取工藝的優(yōu)化條件是A2B2C1，即甲醇濃度60%，超聲提取時間40min，超聲提取溫度28℃，按該條件進行3批放大實驗，平均得率達0.278%。

F檢驗結(jié)果表明（表3），甲醇濃度和提取時間對得率在所考察的范圍內(nèi)影響顯著，而超聲提取溫度在所考察的范圍內(nèi)影響不顯著。

2.6 蒲公英中綠原酸含量 在最佳提取條件下，采用HPLC對焦作地區(qū)采集的4個不同蒲公英樣品進行了3次重復(fù)測定，其含量結(jié)果如表4所示。由表4可知，不同樣品綠原酸的含量差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，超聲提取蒲公英中綠原酸的適宜條件為：甲醇濃度60%，提取時間40min，提取溫度28℃，平均得率達0.278%。樣品的前處理方法對試驗結(jié)果具有重要的影響。目前，在進行蒲公英綠原酸測定時，常采用熱回流法和溶劑浸提法，但提取時間長。為減少提取時間，常采用物理場強化提取是較好的方法。超聲波提取是利用超聲波產(chǎn)生的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，加大介質(zhì)分子的運動速度、增大介質(zhì)的穿透力，從而加速提取生物有效成分，且超聲波提取溫度低、提取率高、提取時間短。因此，用于HPLC分析前的前處理是一適宜的方法。

參考文獻

[1]梁引庫，張萍，李云祥，等.蒲公英活性物質(zhì)對陰道加德納菌的抑制及作用機理研究[J].藥物分析雜志，2020，40（03）：462-469.

[2]侯榮榮，杜峰濤，鄒星月，等.蒲公英的活性物質(zhì)及其應(yīng)用研究進展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2019，25（22）：27-28

[3]延永，張亦琳，吳永玲，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英總黃酮提取工藝及其抑菌活性[J].廣西林業(yè)科學(xué)，2019，48（02）：223-228.

[4]侯榮榮，杜峰濤，鄒星月，等.蒲公英的活性物質(zhì)及其應(yīng)用研究進展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2019，25（22）：27-28，53.

[5]李歡，許艷艷，高進勇，等.蒲公英根多糖的體外抗炎作用研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2019，40（05）：75-78.

[6]饒志威，杜光，姜瓊，等.蒲公英根多糖的研究進展[J].海峽藥學(xué)，2019，31（05）：34-36.

[7]李艷芝，劉樹玲，劉文杰，等.蒲公英黃酮類成分超聲輔助半仿生提取及含量測定[J].濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2020，43（01）：5-9.

[8]夏琴，張新選.HPLC法測定蒲公英中綠原酸和咖啡酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2019，34（04）：462-465.

[9]李盛建，王慧，呂磊，等.HPLC-DAD法同時測定蒲公英配方顆粒中6種成分的含量[J].中南藥學(xué)，2019，17（10）：1714-1717.

[10]肖開心，朱瀅嘉，陳瑞，等.蒲公英水煎液主成分咖啡酸含量測定的方法學(xué)研究[J].貴州科學(xué)，2019，37（06）：47-50.

（責(zé)編：張宏民）