土壤真菌Tolypocladium sp. HU35P-1次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的研究

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016）

真菌為土壤中的主要微生物，有分解有機(jī)質(zhì)、為植物提供養(yǎng)分等功能。研究表明，土壤真菌的次級代謝產(chǎn)物種類繁多、資源豐富，有優(yōu)越的藥用活性，在發(fā)現(xiàn)新藥及新的先導(dǎo)化合物研究中有廣闊的前景[1-2]。從云南大圍山土壤樣品中分離得到一株真菌HU35P-1，通過體外抗腫瘤試驗(yàn)確定其具有較好的生物活性，依據(jù)菌落形態(tài)特征及ITS rDNA測序分析鑒定為Tolypocladiumsp. HU35P-1。為尋找新藥的先導(dǎo)化合物，分離其次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分，得到3個化合物，根據(jù)其理化性質(zhì)并綜合運(yùn)用波譜技術(shù)，鑒定這3個化合物分別為tolypyridone A（1）、尿嘧啶（uracil）（2）、3-甲基哌嗪2, 5-二酮（3）。其中，化合物1為首次從彎頸霉屬中分離得到。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker-ARX-400型核磁共振儀；Bruker AV-600 型核磁共振儀；Shimadzu LC-10ATvp型分析型高效液相色譜儀；Shimadzu LC-8A型制備型高效液相色譜儀；薄層色譜硅膠，柱色譜硅膠（青島海洋化工）；Sephedex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech公司）。

1.2 試藥

甲醇，乙酸乙酯，丙酮（均為分析純）；甲醇，乙腈（均為色譜純）；氘代試劑（美國CIL公司）。

2 提取分離

取Tolypocladiumsp. HU35P-1的大米培養(yǎng)基500 g，將其搗碎，加入等體積的乙醇溶液（濃度95 %），浸泡、超聲處理40 min，提取液減壓濃縮，后放置通風(fēng)處揮發(fā)。用等體積的乙酸乙酯溶液萃取3次，提取液減壓濃縮，得到35 g乙酸乙酯萃取物，經(jīng)硅膠柱色譜[二氯甲烷-甲醇（100:0→0:100梯度）]粗略洗脫分離，得到3個餾分，將3個餾分分別經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、制備HPLC色譜分離純化，分別得到化合物1～3。

圖1 化合物～3結(jié)構(gòu)

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末（甲醇），254 nm紫外燈下明顯暗斑，[α]20D：-77.3（c 0.5，MeOH），三氯化鐵反應(yīng)為陽性，推測存在酚羥基；1H-NMR（400 MHz， DMSO-d6）低場區(qū)有2個活潑氫質(zhì)子信號：一個氮?dú)滟|(zhì)子信號δH9.37（1H，br s， NH-1），一個酚羥基氫信號δH10.98（1H，br s，OH-7’）；δH7.20（2H，d，J=8.5 Hz，H-2’/6’）、6.70（2H，d，J=8.5 Hz，H-3’/5’）推測含一對二取代苯環(huán)片段，δH7.00（1H，s，H-6）為氮雜環(huán)上的氫信號；高場區(qū)顯示3個叔碳上的甲基質(zhì)子信號δH0.92（3H，d，J=6.3 Hz，H-16），1.03（3H，d，J=6.3 Hz，H-15），1.20（3H，d，J=6.0 Hz，H-14）；δH3.67（1H，m，H-13）為連氧碳上的氫。13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）譜中δc 129.8（C-2’），129.8（C-6’），114.8（C-3’），114.8（C-5’），125.0（C-1’），156.2（C-4’）為苯環(huán)上的碳信號，δc 162.8（C-4），162.3（C-2），130.3（C-6），113.1（C-5），111.0（C-3）為雜環(huán)上的碳信號，δc 22.9（C-15）、22.3（C-16）、18.8（C-14）為甲基碳信號，提示化合物為吡啶酮類生物堿。其圓二色譜（CD）譜圖（圖2）在200～225 nm區(qū)域顯示強(qiáng)負(fù)cotton效應(yīng)，在225～250 nm區(qū)域顯示正cotton效應(yīng)，與文獻(xiàn)[3]報道完全一致，化合物1碳?xì)湫盘柸珰w屬見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致，故確定化合物1為tolypyridone A。

圖2 化合物1的CD圖譜

化合物2：棕色粉末（甲醇），254 nm紫外燈下沒有暗斑存在，10 %（v/v）硫酸乙醇溶液不反應(yīng)。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）譜中δH11.0 （1H，s，N-H），10.81（1H，s，N-H）為活潑酰胺氮?dú)滟|(zhì)子信號，δH7.38（1H，d，J=6.0 Hz，H-6），5.44（1H，d，J=6.0 Hz，H-5），13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）譜中δC164.3（C-4），151.5（C-2），142.2（C-6），100.2（C-5）為嘧啶環(huán)上各個位置的信號。其碳?xì)鋽?shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照一致[4]，故確定化合物2為尿嘧啶。

化合物3：白色粉末（甲醇），254 nm紫外燈下沒有暗斑存在。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）譜中，δH8.15（1H，s，H-1），7.97（1H，s，H-2）為活潑氫質(zhì)子信號；δH3.84（1H，q，J=7.0 Hz，H-3）為一次甲基氫質(zhì)子信號，δH3.72（2H，s，H-6）為一亞甲基氫信號，δH1.25（3H，d，J=7.0 Hz，H-7）為甲基氫信號，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]對比一致，因此確定該化合物3為：3-甲基哌嗪2，5-二酮（3-methylpiperazine-2，5-dione）。

表1 化合物1的1H-NMR 和 13C-NMR數(shù)據(jù)（DMSO-d6）