芪精鎮(zhèn)痛顆粒質量標準研究

張秋紅，賈慶文

（1. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102；2. 山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司，山東 濟南250101）

芪精鎮(zhèn)痛顆粒，是依據山東已故中醫(yī)藥名家周鳳梧教授擬定的芪精鎮(zhèn)痛湯[1]治療氣血虧虛型頭痛的經驗組方研制而成的制劑，目前為濟南某醫(yī)療機構自制制劑，由炙黃芪、當歸、茯苓、炙甘草、大棗、川芎、升麻等十味中藥組成。經多年臨床使用證明，該制劑在補氣養(yǎng)血、疏風散痛等方面有較好療效，臨床上主要用于氣血虧虛型頭痛。原制劑質量標準簡單，僅有當歸、川芎的薄層色譜（TLC）鑒別和常規(guī)制劑通則項下的檢查項目，缺少君藥與其他藥味的鑒別和含量測定，無法較全面控制制劑質量。為保證芪精鎮(zhèn)痛顆粒質量滿足療效，同時符合山東省醫(yī)療機構制劑標準提高的要求，本實驗從定性定量兩個方面對該制劑進行全面研究，以期達到控制其質量的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-20A檢測器（日本島津）； AE-100型電子天平（Mettler）；AE-240電子天平（Mettler）；WINCATS薄層照相系統(tǒng)（CAMAG）；硅膠G薄層板（Merck）；定量毛細管（美國Drummond公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（上?？坪悖?。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717），黃芪對照藥材（批號：121462- 201705），升麻對照藥材（批號：121182-201102），甘草對照藥材（批號：120904- 201620），阿魏酸對照品（批號：110773-201915），異阿魏酸對照品（批號：111698-201904）均購自中國食品藥品檢定研究院。芪精鎮(zhèn)痛顆粒（濟南某醫(yī)療機構自制制劑，批號：20190108，20190110，20190201，20190210，20190301，20190310，20190401，20190410，20190501，20190510）。甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別[2]

2.1.1 炙黃芪[3]取本品顆粒3 g，加水5 ml使浸潤，加入用水飽和的正丁醇30 ml，搖勻，超聲10 min，濾過，濾液用氨試液洗滌2次，每次25 ml，取正丁醇液，蒸干，加甲醇1 ml溶解殘渣，作為樣品溶液。另取黃芪對照藥材1 g，同法制成黃芪對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的黃芪甲苷對照品液。取去除炙黃芪制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。吸取上述黃芪甲苷對照品液2 μl，其余3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴硫酸乙醇溶液（1→10），105 ℃加熱顯色。供試品色譜中，與對照品、對照藥材相應位置上，顯棕色至棕褐色斑點；紫外光（365 nm）下顯橙黃色斑點。缺炙黃芪的陰性樣品無干擾，結果見圖1～2。

圖1 炙黃芪的TLC圖（日光下）

圖2 炙黃芪的TLC 圖（365 nm）

2.1.2 升麻[3-4]取本品顆粒3 g，加乙醇30 ml，水浴回流1 h，濾過，蒸干濾液，加乙醇1 ml溶解殘渣，作為樣品溶液。另取升麻對照藥材1 g，同法制成升麻對照藥材溶液。再取異阿魏酸對照品，制成每1 ml含1 mg的乙醇溶液，作為異阿魏酸對照品液。取去除升麻制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺升麻的陰性樣品溶液。吸取上述樣品溶液15 μl、對照藥材溶液、對照品液各2 μl、缺升麻的陰性樣品溶液10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）為展開劑，展開，取出，晾干，紫外光（365，254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點。缺升麻的陰性樣品無干擾，結果見圖3～4。

圖3 升麻的TLC 圖（365 nm）

圖4 升麻的TLC圖（254 nm）

2.1.3 炙甘草[3]取本品顆粒3 g，加乙醚40 ml，回流1 h，濾過，棄去乙醚液，殘渣加甲醇30 ml，回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 ml使溶解，再用水飽和的正丁醇20 ml萃取3次，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3次，取正丁醇液蒸干，加甲醇5 ml溶解殘渣，作為樣品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成甘草對照藥材溶液。取去除炙甘草制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺炙甘草的陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一用1 % NaOH制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴硫酸乙醇（1→10）液，105 ℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的3個黃色斑點；紫外光（365 nm）下檢視，顯相同的6個熒光斑點。缺炙甘草的陰性樣品無干擾，結果見圖5～6。

圖5 炙甘草的TLC 圖（日光）

圖6 炙甘草的TLC圖（365 nm）

2.2 HPLC含量測定[2]

2.2.1 色譜條件 島津 Wondasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:9）；檢測波長321 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。理論板數按阿魏酸計應不低于4800。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取阿魏酸對照品、異阿魏酸對照品適量，加70 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸、異阿魏酸各20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取芪精鎮(zhèn)痛顆粒細粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇25 ml，密塞，稱定重量，回流30 min，放冷，用70 %甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 處方中去除當歸、川芎、升麻、酸棗仁后制成芪精鎮(zhèn)痛顆粒含量測定用陰性樣品, 并按2.2.2.2項制備方法制成含量測定用陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗 分別吸取上述3種溶液各10 μl，注入液相色譜儀，混合對照品、供試品及陰性樣品色譜見圖色譜圖見圖7～9。表明該方法專屬性良好。

圖7 對照品溶液的HPLC圖

圖8 芪精鎮(zhèn)痛顆粒樣品溶液的HPLC圖

圖9 芪精鎮(zhèn)痛顆粒含量測定陰性樣品溶液的HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取阿魏酸、異阿魏酸混合對照品溶液（阿魏酸20.2 μg/ml，異阿魏酸20.4 μg/ml）2，5，10，20，40 μl，按2.1.1項下方法分別注入液相色譜儀，測定峰面積。分別以阿魏酸進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標；以異阿魏酸進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪得標準曲線。阿魏酸的回歸曲線方程為Y=5.31×103X+7.90×102，r=1.0000；異阿魏酸的回歸曲線方程為Y=4.84×103X+1.71×103，r=1.0000。結果表明，阿魏酸在40.4～808 ng（r= 1.0000）范圍內線性關系良好，異阿魏酸在40.8～816 ng（r=1.0000）范圍內線性關系良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取批號為20190510的供試品溶液10 μl，室溫下分別于0，2，6，12，18，24 h，注入色譜儀，測定阿魏酸、異阿魏酸峰面積，計算RSD，分別為1.09 %（n=6），1.67 %（n=6）。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好，不影響阿魏酸與異阿魏酸成分的測定。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，注入色譜儀，測定阿魏酸異阿魏酸峰面積，連續(xù)測定6次，計算RSD，分別為0.17 %（n=6），1.28 %（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 稱取同一樣品（批號20190201）6份，每份約1 g，精密稱定，按2.2.2.2項方法制成供試品溶液，每份精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測定阿魏酸、異阿魏酸的含量，計算RSD，結果分別為1.00 %（n=6），1.85 %（n=6）。表明方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 取含阿魏酸0.4683 mg/ml，含異阿魏酸0.2504 mg/ml的芪精鎮(zhèn)痛顆粒（批號20190201）12份，研細，6份精密稱取約0.5 g加入阿魏酸對照品溶液（20.2 μg/ml）10 ml，6份加入異阿魏酸對照品溶液（20.76 μg/ml）10 ml。按2.2.2.2項方法制成不同的12份供試品溶液，按2.2.1項色譜條件，注入液相色譜儀，測定阿魏酸、異阿魏酸峰面積，計算回收率。兩個成分的RSD均未超過2.0 %，表明該方法準確性良好。見表1。

2.2.9 樣品含量測定 稱取樣品粉末各約1 g，精密稱定，制成供試品溶液，分別精密吸取10 μl，注入色譜儀，測定阿魏酸、異阿魏酸含量，結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果

表2 芪精鎮(zhèn)痛顆粒中阿魏酸、異阿魏酸含量

10批樣品含量測定結果均大于0.75 mg/g，根據測定結果規(guī)定本品每1 g含阿魏酸（C21H20O9）與異阿魏酸（C21H20O9）的總量不得少于0.45 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別的討論

3.1.1 炙黃芪 3種提取方法均可用于炙黃芪定性，但用超聲法提取的供試品溶液雜質多，底色較深，且原點附近有黑色斑點拖尾嚴重；用中性氧化鋁柱提取的供試液，能有效除去糖類及脂溶性的干擾。但由于方中所含藥物較多，成分復雜，故無效斑點亦較多。而用堿性溶劑（氨水）提取的供試品溶液能有效去除阿魏酸[5]、異阿魏酸、甘草酸等酸性成分，氨水洗滌的另一重要作用是將其他黃芪皂苷類成分轉化為黃芪甲苷，提高黃芪甲苷的含量，有利于測定。結果表明，色譜分離效果更好，色譜斑點清晰，無干擾，黃芪甲苷斑點的Rf值約為0.42～0.52。綜合考慮，用氨水洗滌法是最簡便可行的提取方法。但預飽和后仍有較為明顯的邊緣效應，需進一步查找原因找出可行方法減少邊緣效應影響。

3.1.2 升麻 在此實驗中，以苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）為展開劑進行展開，但在薄層板上出現展開劑前沿分層，考慮到所購的預制板結構不穩(wěn)定，會影響展開效果；且展開劑本身極性不同，存在分層。綜合考慮，將預制板先放入展開劑中空跑一遍，晾干，再作為展開板使用，效果可靠、明顯。結果表明，經篩選優(yōu)化后的條件，用于升麻的TLC鑒別，其分離效果好，斑點邊緣清晰、圓整，不擴散，無拖尾，無邊緣效應，可用于芪精陣痛顆粒中升麻的TLC定性鑒別分析。

3.1.3 炙甘草 炙甘草的TLC圖譜顯示，處方中其他成分及輔料均無干擾。該方法專屬性強，重現性好，靈敏度高，且陰性無干擾，可用于芪精鎮(zhèn)痛顆粒的質量控制。

3.2 HPLC含量測定的討論

3.2.1 含量測定中供試品溶液的制備 分別采用70 %甲醇溶液、70 %乙醇溶液、50 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液，10 %乙醇和70 %甲醇制備供試品溶液，測得含量相差不大，但過濾困難。以50 %乙醇、70 %乙醇溶液和70 %甲醇溶液為溶劑制備供試品溶液，測得含量差異較大，且50 %乙醇溶液過濾困難。綜合考慮，最終選用70 %甲醇作為供試品溶劑。

3.2.2 陰性對照品制備 參照文獻[5-8]，當歸、川芎、升麻、酸棗仁含所測成分，故選用剩余五味中藥按處方工藝制備陰性對照品。

3.2.3 檢測波長選擇 根據阿魏、異阿魏酸在70 %甲醇溶液中的紫外吸相關文獻[4,9-17]，選擇321 nm為檢測波長。

3.2.4 流動相的選擇 首先選用甲醇-1 %醋酸溶液（30:70），但阿魏酸、異阿魏酸達不到分離效果。后改變甲醇-1 %醋酸溶液比例（13:87），異阿魏酸分離效果不好，后選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）作為流動相，異阿魏酸分離效果不好，后選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87），結果表明，阿魏酸、異阿魏酸分離效果良好，故選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）為流動相。

3.2.5 含量測定結果分析 本實驗建立了HPLC同時測定2種成分阿魏酸、異阿魏酸的含量，該方法精密度良好，靈敏度高，專屬性好，可用于芪精鎮(zhèn)痛顆粒中阿魏酸、異阿魏酸的含量測定。

綜上，建立的質量標準方法簡便可行，使芪精鎮(zhèn)痛顆粒的質量得到有效控制。