一測多評法測定不同產(chǎn)地紫蘇子中4種活性成分的含量△

楊文惠，羅宇琴，孫冬梅，潘禮業(yè)，魏梅，霍文杰，陳向東

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

紫蘇子為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt. 的干燥成熟果實(shí)，秋季果實(shí)成熟時采收，除去雜質(zhì)，曬干。紫蘇資源在我國分布范圍較廣，分布于廣東、廣西、湖北、云南、貴州、四川、臺灣、浙江、安徽、福建等省區(qū)[1-2]，紫蘇屬植物喜溫、短日照，適應(yīng)能力強(qiáng)。紫蘇子的化學(xué)成分主要包括黃酮類、揮發(fā)性成分、酚酸類、脂肪酸及無機(jī)元素等，其中酚酸類成分包括咖啡酸-3-O-葡萄糖苷、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷等，此外還包括黃酮類如木犀草素、芹菜素等，其性溫，味辛，具有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便的功能，臨床主要用于痰壅氣逆、咳嗽氣喘、腸燥便秘等。目前,文獻(xiàn)對紫蘇子的含量測定研究多集中于對不飽和脂肪油，如α-亞油酸、α-亞麻酸、迷迭香酸及木犀草素等成分，而咖啡酸、芹菜素等的含量測定研究報道較少，而中藥多以有效成分群發(fā)揮其藥用價值，因此，采用一測多評法(QAMS)[3-6]研究有其明顯的應(yīng)用價值。

QAMS是利用中藥中有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定1個有效成分(性質(zhì)穩(wěn)定且易得到的對照品)來實(shí)現(xiàn)多個成分(性質(zhì)不穩(wěn)定且難得到的對照品)的同時測定[3-6]，該方法快速、簡便并且能實(shí)現(xiàn)同時檢測多個成分，是一種符合中藥多成分特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評價模式，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制工作當(dāng)中。

本研究采用高效液相色譜法同時測定紫蘇子中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素的含量，并利用上述4種化學(xué)成分之間的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，建立一測多評方法，選用含量較高的迷迭香酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，得到咖啡酸、木犀草素、芹菜素與迷迭香酸之間的相對校正因子(f)，計(jì)算這各化學(xué)成分的含量，為中藥材紫蘇子多成分含量的測定與質(zhì)量控制提供了全新的分析模式。

1 材料

1.1 儀器

儀器：Waters超高效液相色譜儀(沃特世公司，H-Class)，Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，Agilent SB C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，YMC Triart色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，萬分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E)，百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，HWS-28)，數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ500DE)，超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 試藥

本實(shí)驗(yàn)所用的紫蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為紫蘇子P.frutescens(L.)Britt.的干燥成熟果實(shí)，樣品保存于質(zhì)量中心，樣品采集信息見表1。

表1 紫蘇子樣品信息

咖啡酸對照品(批號：110885-201703，純度：99.7%)、迷迭香酸對照品(批號：110871-201706，純度：90.5%)、木犀草素對照品(批號：111520-201605，純度：99.6%)、芹菜素對照品(批號：111901-201603，純度：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑1.8 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按梯度洗脫(0～6 min，10%～18%A；6～15 min，18%～50%A)；流速為0.3 mL·min-1；檢測波長為330 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素適量，加80%甲醇溶液制成含咖啡酸32.662 μg·mL-1、迷迭香酸256.658 μg·mL-1、木犀草素36.364 μg·mL-1、芹菜素37.751 μg·mL-1的混合對照品儲備液。再取混合對照品儲備液1 mL，加80%甲醇定容于10 mL，得到混合對照品溶液每1 mL含咖啡酸3.266 μg、迷迭香酸25.666 μg、木犀草素3.636 μg、芹菜素3.775 μg。置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取紫蘇子飲片粉末(過二號篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適用性 取上述混合對照品儲備液，分別稀釋500、1000、4000、8000倍得到混合對照品的定量限(LOQ)及檢測限(LOD)，見表2，其混合對照品及樣品色譜圖見圖1。各色譜峰分離度良好，經(jīng)Waters二極管陣列檢測器檢測，所有目標(biāo)峰的峰純度角均小于純度閾值。表明各色譜峰專屬性較好。

表2 紫蘇子中4個成分檢測限及定量限結(jié)果 μg·mL-1

2.4.2線性考察 分別精密吸取對照品儲備液5.0、2.0、1.0、0.5、0.2 mL，加80%甲醇定容于10 mL，搖勻，得到一系列線性對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表3。

注：A：混合對照品圖；B：供試品色譜圖。圖1 紫蘇子混合對照品及樣品色譜圖

2.4.3精密度考察 精密吸取2.2同一混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算4種成分峰面積的RSD，結(jié)果咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素峰面積的RSD(n=6)分別為0.31%、0.28%、0.36%和0.20%。說明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，計(jì)算4種成分的峰面積的RSD，結(jié)果咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素峰面積的RSD(n=6)分別為1.37%、0.60%、3.00%和1.70%。說明樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5重復(fù)性考察 稱取同一批紫蘇子樣品(過二號篩)約0.5 g，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測定，測得咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.002 9%、0.36%、0.019%、0.006 3%，其RSD(n=6)分別為1.44%、0.91%、3.74%和2.86%，表明方法重復(fù)性良好。

表3 紫蘇子中4個成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.6加樣回收率考察 取同一批已知含量的樣品約0.25 g，平行6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照與所取樣品中待測定成分量之比控制在1∶1左右濃度水平精密加入對應(yīng)的對照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均加樣回收率分別為111.57%、101.97%、95.11%和98.33%，其RSD(n=6)分別為3.32%、0.30%、2.76%和5.40%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 校正因子考察

2.5.1校正因子計(jì)算 取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μL，以迷迭香酸為內(nèi)標(biāo)，按公式f=As×Ci/(Ai×Cs)(式中Ci為內(nèi)標(biāo)物濃度，Ai為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為組分s濃度，As為組分s峰面積)計(jì)算咖啡酸、木犀草素、芹菜素的相對校正因子分別為1.69、1.05、1.42。

2.5.2待測成分的色譜峰定位 色譜峰的準(zhǔn)確定位是保證一測多評法應(yīng)用的前提，本實(shí)驗(yàn)以相對保留時間(待測成分與內(nèi)標(biāo)成分保留時間之比)作為定位標(biāo)準(zhǔn)，并在不同柱溫、不同流速、不同品牌色譜柱及不同色譜儀下對此參數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果分別見表4～7，得到不同流速、不同柱溫、不同色譜儀條件下咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的相對保留時間波動在3%左右，當(dāng)色譜柱粒徑為1.9 μm時，咖啡酸的相對保留時間偏差較大。因此固定色譜柱粒徑為1.8 μm時，結(jié)果表明可將此參數(shù)用于目標(biāo)峰的定位。

2.5.3校正因子耐用性考察 由本實(shí)驗(yàn)室不同操作人員，在不同實(shí)驗(yàn)日期，采用不同實(shí)驗(yàn)儀器，取同一份樣品，按照供試品溶液制備方法，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，并在不同柱溫、不同流速、不同品牌色譜柱及不同色譜儀下對校正因子進(jìn)行考察，結(jié)果分別見表4～7，得到不同流速、不同柱溫、不同色譜儀條件下咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的校正因子波動3%左右，當(dāng)色譜柱粒徑為1.9 μm時，校正因子偏差較大。因此固定色譜柱粒徑為1.8 μm時，表明方法耐用性良好。

2.6 樣品測定

取紫蘇子藥材10批，按2.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，按照分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液及迷迭香酸對照品溶液各1 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定。通過外標(biāo)法得到上述4種成分的含量，再按照建立的QAMS進(jìn)行4個成分色譜峰的定位，并對其含量進(jìn)行實(shí)際測算，計(jì)算2種方法所得各成分含量的相對平均偏差(RE)，以驗(yàn)證QAMS的合理性。結(jié)果見表8。通過2種方法測得的各成分的含量的相對平均偏差<3%，說明該方法的可信度較高。

表4 紫蘇子中4種成分不同流速的含量測定、相對保留時間及校正因子結(jié)果

表5 紫蘇子中4種成分不同柱溫的含量測定、相對保留時間及校正因子結(jié)果

表6 4種成分不同色譜柱的含量測定、相對保留時間及校正因子結(jié)果

表7 4種成分不同色譜儀的含量測定、相對保留時間及校正因子結(jié)果

表8 不同產(chǎn)地紫蘇子中4種成分樣品測定結(jié)果(外標(biāo)法和QAMS)

2.7 不同產(chǎn)地紫蘇子藥材的聚類分析

基于QAMS的測定結(jié)果，對上述10批不同產(chǎn)地的紫蘇子藥材進(jìn)行分析，通過SPSS V20版軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到聚類分析結(jié)果見圖2。

圖2 紫蘇子藥材聚類分析結(jié)果

從上圖可知，以歐氏距離<10，可將10批紫蘇子藥材分為3類，其中G1612281、G1805041、G1807021、G1807022、G1807020、G1807042為第一類，G1807015、G1807023為第二類，G1807041、G1807043為第三類，第一類的產(chǎn)地分布較多，包括河南省安陽市龍安區(qū)、甘肅省慶陽市寧縣、甘肅省慶陽市正寧縣、甘肅省涇川縣、河北省安國市，第二類產(chǎn)地包括廣東省英德市大灣鎮(zhèn)、甘肅省慶陽市寧縣，第三類河北省安國市，主要為不存在明顯的產(chǎn)地差異性，進(jìn)一步分析各類之間的含量配比，以迷迭香酸-木犀草素-芹菜素三者含量比例關(guān)系來看，第一類的迷迭香酸-木犀草素-芹菜素接近66∶2.5∶1，第二類的接近165∶2∶1，第三類的接近34∶1.6∶1，由此來看，紫蘇子藥材不同各產(chǎn)地成分間的差異可能較小，提示以不同成分的含量配比之間可能與其植物變異及種源鑒定間存在一定關(guān)聯(lián)。

3 討論

《中華人民共和國藥典》2015年版紫蘇子項(xiàng)下藥材含量測定以迷迭香酸為指標(biāo)，從各成分含量測定的結(jié)果來看，其含量較高，且易于得到，因此，選迷迭香酸作為內(nèi)標(biāo)，基于咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素均值330 nm處有最大吸收，因此建立上述2種酚酸類及黃酮類成分的含量測定QAMS。本研究分別考察了不同料液比、不同提取溶劑、不同提取方式及不同提取時間對4種成分的含量，得到當(dāng)料液比為0.5∶25 g·mL-1，以80%甲醇作為提取溶劑，加熱回流處理60 min時，所得提取效率較高。

唇形科紫蘇屬1年生草本植物蘇Perillafrutescens(L.) Britt.有1個種、3個變種和7個變型，紫蘇有葉兩面紫色(其種子簡稱為雙紫蘇子)和面綠背紫(其種子簡稱為單紫蘇子)2個變型，有文獻(xiàn)報道兩者之間含量差異較大[7]。但以種子入藥后，因缺乏對原植物的形態(tài)鑒定，單一的含量測定指標(biāo)，難以對種子的變異或者對種子規(guī)格進(jìn)行區(qū)分。本研究通過建立一測多評的方法，得到10批紫蘇子的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.000 6%～0.003%，迷迭香質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%～0.38%，木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%～0.016%，芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%～0.006%，并對不同成分之間的含量比例關(guān)系進(jìn)行分析，為種源研究提供了新思路。